071020第四章 复制1.ppt

(1)DNA聚合酶Ⅰ 编码基因 polyA基因座,是第一个被鉴定的DNA聚合酶。 分子结构 103kDa的单链多肽。 细胞内含量 每个细胞内400个分子。 聚合效率 每分种可催化1000个核苷酸的聚合。 催化活性 5’→3’聚合酶活性；3’→5’外切核酸酶活性；5’→3’外切核酸酶活性。 水解片段 用蛋白酶将其有限水解，可得到68kDa和36kDa的两个片段。68kDa称为大片段或Klenow片段。 Klenow片段的结构与催化活性 C端的2/3具有聚合酶活性；N端的1/3具有3’→5’外切核酸酶活性。两个活性位点距离为3nm；表明碱基的加入和去除功能在空间上是分开的。 (1)DNA聚合酶Ⅰ Klenow片段的结构与催化活性 C端的2/3具有聚合酶活性；N端的1/3具有3’→5’外切核酸酶活性。两个活性位点距离为3nm；表明碱基的加入和去除功能在空间上是分开的。 小片段(35kDa)的催化活性与功能 有5’→3’外切核酸酶活性。可以切除少量的核苷酸，一次最多切10个碱基。在切除由紫外线照射而形成的嘧啶二聚体中起重要作用，在DNA的半不连续合成中，切除冈崎片段5’端RNA引物。与大亚基的聚合校对功能协同，使DNA聚合酶Ⅰ在体外具有从切口处起始复制的独特功能。 (1)DNA聚合酶Ⅰ Klenow片段的结构与催化活性 C端的2/3具有聚合酶活性；N端的1/3具有3’→5’外切核酸酶活性。两个活性位点距离为3nm；表明碱基的加入和去除功能在空间上是分开的。 小片段(35kDa)的催化活性与功能 有5’→3’外切核酸酶活性。可以切除少量的核苷酸，一次最多切10个碱基。在切除由紫外线照射而形成的嘧啶二聚体中起重要作用，在DNA的半不连续合成中，切除冈畸片段5’端RNA引物。与大亚基的聚合校对功能协同，使DNA聚合酶Ⅰ在体外具有从切口处起始复制的独特功能。 Klenow片段是一种重要的工具酶 (1)DNA聚合酶Ⅱ 分子结构 120kDa的单链多肽。 细胞内含量 每个细胞内100个分子。 聚合效率 很低，只有DNA聚合酶Ⅰ的5%，每分种可催50个核苷酸的聚合。 催化活性 5’→3’聚合酶活性；3’→5’外切核酸酶活性。 功能 在DNA的修复中起一定作用。 (1)DNA聚合酶Ⅲ 功能 是负责大肠杆菌细胞DNA合成的复制酶replicase。 亚基 是多亚基组成的蛋白质，全酶含10种共18个亚基。 细胞内含量 10至20个。 全酶功能分区 全酶含4个不的功能组分，分别为核心聚合酶 core polymerase,β二聚体，γ复合物，τ二聚体。 PolⅢ*结构模型 (1)DNA聚合酶Ⅲ (1)核心聚合酶 core polymerase 核心聚合酶由α、ε、θ三种亚基组成，称为PolⅢ。 α亚基 分子量为30kD，由dnaE编码合成,具有5‘-3’方向合成DNA的催化活性，每秒可以合成8个核苷酸。 ε亚基 具有3‘－5’外切核酸酶的校对功能，由dnaQ编码合成。在体内ε亚基的基本功能是控制复制的忠实性，这可由dnaQ突变体的表型所证实，在细菌株中突变发生的机率增加了103倍。 ε亚基常与α亚基形成一个紧密的1:1复合物，协同作用。 核心酶的数量和活性 在细胞中，大约有40个分子的核心酶，其中只有一半被组装到全酶中。核心酶的活性较低，以大约每秒20个核苷酸的速度合DNA。 (2)β二聚体 β亚基是以二聚体的形式存在的。 (1)DNA聚合酶Ⅲ (1)核心聚合酶 core polymerase (2)β二聚体 β亚基是以二聚体的形式存在的。 滑动钳 β二聚体是环状的，在其间有一个足以容纳DNA双螺旋的大空间。β二聚体环绕着DNA，并能在DNA上自由滑动，构成一个滑动钳。 滑动钳的作用 滑动钳可把全酶束缚在模板DNA上，从而保证高度的进行性（即全酶结合于单链模板不解离的能力）。当PolⅢ*结合β钳时，全酶的进行性可从每次聚合10个核苷酸升高到每次聚合50000个核苷酸，聚合反应速度从每秒20个核苷酸上升到每秒750个核苷酸。因此β钳的存在对大肠杆菌染色体的高效复制是十分重要的。 β亚基的数量 β亚基可以很容易地从全酶中脱离。与核心酶相比，在细胞中β亚基的含量很丰富，大约每个细胞中含300个二聚体。 (1)DNA聚合酶Ⅲ (1)核心聚合酶 core polymerase (2)β二聚体 (3)γ复合物 γ复合物的功能 γ复合物是β滑动钳的载体（loader），可帮助β滑动钳结合到DNA上。 γ复合物的结构 γ复合物含有5个不同的亚基，形成一种化学计量为γ2δ1δ‘1χ1ψ1的结构。δ和δ’亚基是由不同基因编码产生的不同蛋白质。 γ复合物装载β二聚体的机制 γ复合物有依赖