抗VWF-A3区特异性单抗SZ-123单链抗体的制备和生物学特性的研究.pdf

抗vWF-A3区特异性单抗SZ一123单链抗体的制备和生物学特性研究 中文摘要 学特性研究 中文摘要 研究背景： 血栓性疾病严重威胁着人类的健康，血栓形成机制的研究是医学科学领域重大课 题之一。动脉血栓是造成90％以上的心肌梗死、80％脑卒中的主要原因，动脉栓塞性 心血管疾病一直是发达国家首位的死亡原因。血小板在血栓形成特别是动脉血栓形成 中起着重要作用。因此抗血小板治疗是预防和治疗血栓性疾病的重要措施。临床广泛 使用的经典抗栓药物如第一代的阿司匹林，噻氯吡啶等，可相应地抑制血小板活化过 a与纤维蛋白原(Fg)结合为主要机制。近年来针对动脉血栓形成早期阶段的研究， Willebrandfactor，vWF)-GPI 其中胶原-血管性血友病因子(von b轴各分子间相互 作用的分子机制及抗血栓治疗新靶点的研究已成为血栓与止血领域中的热点和前沿 I 科学问题之一。由于针对胶原-vWF-GPb轴来阻止血小板的早期粘附和活化，具有 更早、更好的抗栓活性，并减少出血危险性，形成新一代的抗栓药物，因此具有更为 广阔的应用前景。赵益明等之前报道了～株特异性针对vWF-A3区的单克隆抗体 (monoclonal I 抑制瑞斯托霉素诱导的血小板聚集(血小板膜糖蛋白GPb结合于vVi／F-A1区)， 这一结果提示vWF_A3区胶原结合部位可能动态调节vWF-A1区的功能。此外， 能够抑制vWF-A3区与胶原结合，而且抑制瑞斯托霉素诱导的血小板聚集。现己排除 了SZ一123与vWF-A1区的作用，有假设提出是由于mAb SZ一123与vWF-A3作用的 同时影响了vWF-A1区的空间构像，改变了其空间结构，进而影响了vWF-A1区与血 小板的结合，从而产生抗栓的作用。因此，制备分子量较小的单链抗体，更有利于从 中文摘要 抗vwF_A3区特异性单抗SZ一123单链抗体的制各和生物学特性研究 蛋白质空间结构上解释SZ一123的作用机制，这也是制备SZ一123单链抗体的重要意 义所在。 目 的： 本研究旨在利用基因工程手段制备相对于抗vWF-A3区特异性单抗SZ一123分子 量较小的单链抗体，通过原核和真核表达以及体外生物学功能实验验证其是否具有与 SZ一123相似的功能活性，从而从蛋白质空间结构上解释单抗SZ一123与vWF不同功能结 构域相互作用的独特机制，为下一步鼠源单抗SZ一123的人源化和更深一步探讨单抗 SZ一123的抗栓机制提供理论依据，同时也为将来开发基于单抗SZ一123的抗栓药物奠 定基础。 方法： PCR方法将重链和轻链与linker序列拼接成单链抗体(SZ一123ScFv)，构建SZ一123 ScFv原核表达载体并转化到大肠杆菌，完成SZ一123ScFv的原核表达，对其浓缩，然 后用ELISA，Westernblot等方法验证SZ一123ScFv的免疫原性。 PCR方法将重链和轻链与linker序列拼接成单链抗体(SZ一123ScFv)，构建单抗 SDS，WesternBlot等方法验证SZ一123ScFv的免疫原性。 (3)通过胶原结合抑制试验验证SZ一123；单链抗体的功能活性：以人胎盘III型胶 原包板，加入vWF纯品后，再加入原核与真核表达的浓缩纯化后的蛋白孵育，最后 加入辣根过氧化物酶(horseradish (4)通过瑞斯托霉素诱导的血小板聚集实验验证SZ一123单链抗体的功能活性： 抽取健康人柠檬酸钠抗凝的静脉血，分离得到富血小板血浆(PRP)和贫血小板血浆 (PPP)。加入瑞斯托霉素诱导，在血小板聚集仪上检测其抑制血小板聚集功能。 结 果： Ⅱ 抗vWF-A3区特异性单抗SZ一123单链抗体的制备和生物学特性研究 中文摘要 ScFV基因拼接正确。