人胚海马酵母三杂cDNA文库的构建和FMRP相互作用mRNAs研究.pdfVIP

中国协和医科大学硕士论文 中文摘要 脆性x综合征是一种最常见的遗传性智力障碍性疾病，已经证实由脆性x智力 是RNA结合蛋白，其主要功能是结合某些特定类型的mRNAs，并参与调节某些特 定的靶mRNAs的翻译，和／或参与这些mRNAs从细胞核至细胞质，或从神经元细胞 质至树突和突触后的蛋白质合成位点的转运。具体致病机制尚不清楚，但各种研究结 果提示可能是FMRP的缺失引起了某些靶mRNAs，特别是中枢神经系统的某些 mRNAs生理功能异常，从而导致疾病。因此研究体内与FMRP发生相互作用的靶 mRNAs有助于揭示FMRP缺失和各种临床表现之间的关系，。 酵母双杂交系统一直被广泛应用于研究蛋白质与蛋白质之间的相互作用。而酵母 三杂交系统在此基础之上引入了一个可以在酵母体内表达RNA终产物的质粒载体， 如果表达的RNA产物可以和“诱饵”蛋白发生相互作用，就可激活报告基因的表达， 从而筛选阳性克隆。因此被用于在真核细胞内研究蛋白质一RNA之间的相互作用。我 们通过构建酵母三杂交eDNA文库，运用酵母三杂交体系分析RNA．蛋白质相互作用， 研究与FMRP相互作用的mRNAs。 本课题的主旨是用酵母三杂交系统筛选人胚海马内的FMRP靶mRNAs。脆性x 综合征相关基因FMRl在大脑海马区活跃表达，因此我们选用19周胎龄人胚海马 到的独立克隆数约为1×106，文库的插入片段平均长度约为400bp，有效重组克隆百 对我们构建的文库进行筛查，筛选出在酵母体内与FMRP发生相互作用的靶mRNAs。 到论文结稿时止，共发现三个与之相结合的mRNAs，其中两个表达产物功能未 T)。EF．1蛋白水平的增高与无义 知，另一个的表达产物是延伸因子19amma(EF-1 抑制的增加相关，另一方面，EF-1表达增加可能通过改变细胞骨架肌动蛋白来导致 生长缺陷和细胞形态的变化，肌动蛋白相关的树突棘的形状和稳定性的改变是脆性x 中国协和医科大学硕士论文 综合征的特征之一。目前已有研究证实FMRP对EF。1基因的翻译起抑制作用。我们 EF．1基因的表达提供了新的证据。 2 中国协和医科大学硕士论文 Abstract Lossofthe Xmentalretardation to Xsyndrome， fragile FMRP(fragile pmtein)leads form isa commonof mentalretardation．FMRP themost inherited RNA-bindingprotein， interactsome in of whosefunctionisto with mRNAs，and special participateregulation themfrom to from to their nucleus translation,and，or eytoplasm transport cytoplasm，or inneuron．The mecha