酵母谷胱甘肽转移酶Gtt2和甲硫氨酸亚砜还原酶Mxr1的结构和催化机理的研究.pdf

摘要 摘 要 （Ⅰ）自然界中有一类能够损伤细胞或者破坏遗传物质的有毒物质，叫异生质 （xenobiotics ）。它们或者自生物体外进入，或者由体内代谢产生。为了消除这 些有毒的异生质，生物体在漫长的进化过程中产生了一系列成熟有效的解毒机 制。总的来说，这些解毒过程可以分为三个流程：一，通过引入活性功能基团激 活化学性质相对稳定的异生质；二，将异生质上的活性功能基团与其他物质偶联， 生成新的无毒或弱毒物质；三，偶联后的异生质溶解度大幅上升，可以通过膜表 面的通道排出细胞，或者被下游反应最终降解。 谷胱甘肽转移酶（glutathione S-transferase ，GST ，EC 8 ）就是在解毒 第二阶段中发挥重要作用的一种酶。该家族的酶能够催化异生质与谷胱甘肽 （glutathione ，GSH ）巯基的偶联，进而消除异生质的亲电基团，降低毒性，提 高溶解度。真核生物通常含有多个直系同源的谷胱甘肽转移酶，参与不同的反应 流程。在哺乳动物中，胞质内的谷胱甘肽转移酶全都是以二体形式存在，并根据 一级序列被划分为八个主要亚家族：Alpha 、Kappa 、Pi 、Mu 、Theta、Zeta 、Sigma 和Omega 。在对非哺乳动物的研究中，一些新的谷胱甘肽转移酶亚家族被报道， 如细菌内的Beta 亚家族，高等植物中的Phi 和Tau 亚家族，昆虫中的Delta 亚家 族。真菌也含有多种谷胱甘肽转移酶，但是一级序列变化较大，目前无法归入依 照序列划分的分类体系。除了这种分类体系，还有一种根据谷胱甘肽转移酶催化 残基的分类方法。谷胱甘肽转移酶在催化过程中，将依靠某一特定催化残基去降 低谷胱甘肽的pKa 值，通过氢键稳定巯基负离子，从而加速异生质的亲电攻击。 该分类方法依照反应过程中催化残基的类型，将所有的胞内谷胱甘肽转移酶分为 三大类：酪氨酸催化（Tyr- ），丝氨酸催化（Ser- ），半胱氨酸催化（Cys- ）。 目前所有的胞内谷胱甘肽转移酶都可以归入上述三个大类。据报道，催化残基的 突变可以显著降低，甚至完全消除谷胱甘肽转移酶的活性。 在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae ）中，目前发现七种蛋白具有谷胱甘 肽转移酶活性，分别是Gtt1、Gtt2、Gto1、Gto2、Gto3、Grx1 和Grx2 。从已知 的结构看，Grx1 和Grx2 并不属于谷胱甘肽转移酶家族，因为它们没有谷胱甘肽 转移酶的C 端结构域，而只具有N 端结构域。在剩下的五个蛋白均属于谷胱甘 肽转移酶家族，其中Gto1/2/3 被归入谷胱甘肽转移酶Omega 亚家族，Gtt1 和Gtt2 因序列同源度过低而无法归入现有的亚家族。虽然这五个谷胱甘肽转移酶的生理 和生化功能都被广泛研究，但是到目前为止它们的三维结构还没有被报道。因此， 我们展开了一项关于酿酒酵母谷胱甘肽转移酶三维结构的研究。我们解析了酿酒 I 摘要 酵母中谷胱甘肽转移酶Gtt2 的结构（2.23 Å ），以及Gtt2 分别与底物谷胱甘肽 GSH （2.10 Å ）和底物类似物磺化谷胱甘肽GTS （2.20 Å ）的复合物结构。从整 体结构上看，Gtt2 与常见的谷胱甘肽转移酶没有太大区别。但是通过对催化位点 的结构分析、定点突变、光谱学分析和酶活测定，我们发现 Gtt2 与前人报道的 三种催化类型（Tyr-、Ser-、Cys- ）显著不同。Gtt2 是通过C 端结构域上的一个 丝氨酸和一个组氨酸共同稳定的水分子来发挥催化功能的，而不是通过某个催化 残基上的极性原子。另外，同源序列比对、定点突变与酶活测定证明，伸向催化 位点的α1 螺旋的N 端，由于空间位阻的原因，只能是甘氨酸或者丙氨酸这两种 侧链较小的残基。最终，我们定义了一类新的谷胱甘肽转移酶催化类型：非典型 性（Atypical-type ）谷胱甘肽转移酶。 关键词：酿酒酵母，谷胱甘肽转移酶，Gtt2 ，晶体结构，催化类型，定点突变 II 摘要 （Ⅱ）硫氧还蛋白（thioredoxin ，Trx ）是一类广泛存在于自然