白内障患者诱导性多能干细胞iPS的建立及定向分化研究.pdf

白内障患者诱导性多能干细胞(iPS)的建立及其定向分化的研究 中文摘要 cataract，ARC)为全球致盲眼病的主要原 年龄相关性白内障(age．related 因。在我国约有250万人因白内障致盲，占全球白内障致盲总数的10％。随着人 口的老龄化，预计我国每年新增白内障患者将超过100万，而我国的白内障年手 术量尚不足以解决每年的新增例数。因此，我国的白内障盲防治问题十分严峻。 而先天性白内障是指出生前即存在，或出生后才逐渐形成的先天遗传或发育障碍 的白内障，超过1／3的患者是遗传所致。任何参与、影响晶状体发育的基因突变 都可能导致先天性白内障的发生。因此，明确先天性白内障的发病机制对于治疗 及预防先天性白内障的发生发展具有重要的意义。白内障摘除联合人工晶状体 (intraocular lens，IOL)植入是目前治疗白内障最常用且效果较为理想的方法， 而后囊膜混浊(posteriorcapsular 预后的最常见的并发症，其术后5年的发生率高达30％左右。虽然可以利用激 光或者手术切开混浊的后囊膜，但是却增加了病人的经济负担，并会带来新的并 发症。所以如何预防PCO的发生是眼科医生和病人都比较关注的一个问题。 stem 体细胞诱导成为多能干细胞(induced cells，iPSCs)的研究 pluripotent 成果被国际生命科学界誉为具有里程碑意义的创新之举。多能干细胞能够自我更 新，能在体内外分化成几乎所有类型的细胞，在再生医学等方面有巨大的应用潜 力，具有极高的理论研究价值。通常用来源于囊胚期胚胎的内细胞团的胚胎干细 胞、通过核移植得到的胚胎干细胞以及在成体细胞中转入外源转录因子得到的 iPSCs，进行体细胞重编程研究。在短短数年的时间里，此项研究已经在细胞重 编程的机理研究、探索疾病的发生发展机制以及临床医学的应用等领域引发了很 多突破性的进展；而且这一非克隆干细胞技术的诞生，成功地避开了长期以来争 论不休的伦理问题，极大地推动该领域和相关科学领域的发展。与胚胎干细胞研 究相比，体细胞重编程技术可以为更多的患者提供特异性多能干细胞。因而，在 医学应用方面(例如器官培养和器官移植等)有广阔的前景。 患者特异性的多能干细胞的建立能够为疾病发病机制的研究、治疗药物的筛 选及细胞移植治疗提供有力的工具。采用慢病毒载体将外源性转录因子导入白内 障患者晶体上皮细胞，从而获得诱导性多能干细胞。白内障患者来源的多能干细 白内障患者诱导性多能干细胞(iPS)的建立及其定向分化的研究 胞的建立，能够为晶体发育、细胞分化、衰老提供便利的细胞模型，同时可为白 内障治疗药物的筛选及白内障发病机制的研究提供有力的研究工具。 第一部分原代人晶体上皮细胞的体外培养 目的对正常人晶体、年龄相关性白内障晶体上皮细胞及人皮肤成纤维细胞进行 体外培养，并观察体外培养的晶体上皮细胞及皮肤成纤维细胞的生物学特性及组 织学变化。 方法正常人晶体上皮细胞培养取材于角膜移植术后供体眼的晶状体囊膜，年龄 相关性白内障晶体上皮细胞培养取材于白内障超乳手术中撕除的晶体前囊膜。角 膜移植术后供体眼的晶状体沿赤道部后方约2mm环形剪开后囊膜，小心取下完 整的前囊膜和赤道部囊膜，剪成lmm×lmm大小的组织块，利用组织块贴片法， 进行原代人晶状体上皮细胞的培养。白内障晶体前囊膜在超乳手术中完整取材、 洗去粘弹剂之后剪成lmm×lmm大小的组织块，利用组织块贴片法进行培养。 使用O．25％胰酶溶液对融合后的细胞进行消化传代。取年龄相关性白内障患者的 皮肤组织，剪成lmm3大小的组织块，过夜消化，离心收集细胞，经多次传代后， 获得较为纯化的皮肤成纤维细胞进行培养。在倒置相差显微镜下对三种细胞进行 形态学观察。采用CCK．8法连续7天测定三种细胞的增殖速率，绘制生长曲线 并进行比较。 结果正常人晶体囊膜组织块贴壁48～72小时后可见人晶状体上皮细胞从组织 块边缘长出，约10-15天达到融合。初期正常人晶体上皮细胞为多角形，胞体透 亮，细胞边界清晰。融合后的细胞具有上皮细胞的形态特征，为典型的六角形或 多边形。在体外细胞可传五代，但第三代以后细