应用Polscope偏振光显微镜对人类MⅡ卵母细胞、三原核受精卵的纺锤体及其卵裂阶段胚胎透明带结构的观察分析.pdfVIP

摘要 在普通光学显微镜下，人类卵母细胞是半透明的，无法对其纺锤 体以及透明带的结构进行观察和分析。而其他的成像法都需要破坏卵 一种光学特性。Polscope偏振光显微镜(Polarizedlight 可以检测到偏振光经过双折射性的样品时产生的光程差(optical path 的样品，它能观察活细胞的动态结构而不破坏细胞。 人类卵母细胞内具有双折光性的结构包括透明带和纺锤体。应用 Polseope偏振光显微镜，能够对卵母细胞内纺锤体以及透明带结构 进行非侵入性观察和分析，同时并不影响卵母细胞以及未来胚胎的发 育潜能。纺锤体是进行减数分裂以及有丝分裂时重要的细胞器；透明 带在人类植入前胚胎发育的不同阶段发挥着重要的作用。人类纺锤体 以及透明带结构的活体观测及分析，对于理解早期人类胚胎发育生物 学中的一些基本事件具有重要的意义，在未来辅助生殖领域内将有广 泛的应用。 本研究分为三个部分，其主要实验方法及实验结果如下： 一 第一部分应用偏振光显微镜对人类MlI卵母细胞进行去核 在前期的工作中，本研究所的陆长富等通过注核一去核法以及精 子提取物同时激活的方案，获得了人类体细胞核移植囊胚。 在此部分研究中，我们首先在前期工作的基础上，比较了不同激 活时间对于人类体细胞核移植胚胎发育的影响。使用注核一去核法 采用注核后2小时进行精子提取物激活的方案，43被采用同时激活 方案。结果显示，在方法1后激活组中，15枚重构胚发生卵裂，其 中4枚为优质胚胎，2枚发育到囊胚阶段；卵裂率、优质胚胎率以及 囊胚形成率分别为65．2％，22．6％以及13．3％。在方法1同时激活组中， 16枚重构胚发生卵裂，卵裂率为72．7％，无优质胚胎以及囊胚形成。 方法1后激活组的优质胚胎率高于同时激活组。结果提示，注核2小 时后进行精子提取物激活的方案，有利于人类细胞核移植胚胎发育。 细胞进行去核的方案(方法2)对于体细胞核移植的可行性。使用去 核一注核法(方法2)对29枚人类MII卵母细胞进行体细胞核移植， 并同时使用精子提取物激活。结果显示，使用Polscope能够在去除 人类MII卵母细胞中的纺锤体～染色体复合物。在方法2同时激活组 中，8枚重构胚发生卵裂，其中3枚为优质胚胎，1枚发育到囊胚阶 段，卵裂率、优质胚胎率以及囊胚形成率分别为88．9％、37．5％以及 12．5％。方法2同时激活组的优质胚胎率高于方法1同时激活组。以 去核，是一种可行的人类体细胞核移植方案。 核的同时进行了拍摄，分析了第一极体与MII纺锤体的位置关系。结 果显示，第一极体是帮助寻找MII卵母细胞纺锤体的良好标志物。 II 第二部分应用偏振光显微镜观察分析去原核前后人类体外受精三原 核受精卵第一次有丝分裂的纺锤体结构 在此部分研究中，我们在去除多余雄原核前后，对人类IVF来源 的三原核受精卵(tripronuclear 以及体外发育的情况进行了观察，并使用Polscope偏振光显微镜以 及免疫荧光法对其第一次有丝分裂时纺锤体的形态结构进行了分析， 同时评估了这两种方法的吻合度。结果显示，人类IVF来源的三原核 受精卵在去原核前后，均存在1：2以及l：3两种卵裂方式，两组间 比例无显著性差异。去原核前后，第3天胚胎的优质胚胎率无显著性 差异，而第5天去原核后3PN受精卵的囊胚形成率(16．0％)高于未 来源的三原核受精卵在去原核前后，均存在纺锤体结构的异常，去原 核前后纺锤体结构异常率分别为67．4％和50．5％，两组间比例无差异。 使用免疫荧光法也获得了类似的结果。对于23个样本先后使用 Polscope偏振光显微镜以及免疫荧光法分析结果显示，两种方法的 检测结果无差异，具有中度吻合性。以上结果提示，人类IⅦ来源的 3PN受精卵在第一次有丝分裂时，存在各种类型的纺锤体结构以及数 目异常。去除多余的原核后，并未逆转其有丝分裂纺锤体的异常程度。 使用Polscope偏振光显微镜能够对人类受精卵第一次有丝分裂的纺 锤体结构进行较为准确的观察和分析。 III 第三部分应用偏振光显微镜定量检测人类新鲜及冷冻一解冻胚胎透 明带多层结构对偏振光的阻滞性 在本部分的研究中，根据体外培养第3天的形态学指标将人类卵 裂阶段新鲜胚胎分为优质新鲜胚胎以及质差新鲜