糖尿病基因诊断医学PBL.ppt

Pax6基因是Pax多基因转录因子家族成员之一，是与胰腺发育、α细胞分化、高血糖素基因的转录和激活、β细胞功能以及胰岛素表达密切相关的关键转录因子，在众多调节胰腺细胞发育的基因中发挥中心作用，其突变／变异已成为糖耐量异常和早发糖尿病的致病原因或易感位点。 Pax6在调节B细胞发育的基因中发挥中心作用 。Pax6则同时参与胰腺分泌高血糖素的α细胞分化、成熟以及B细胞的分化及其胰岛素的表达。此外，Pax6在胰腺β细胞高血糖素的转录调节中发挥重要作用。 Pax6最先从人类、小鼠、鱼、斑马中分离得到，其蛋白序列和功能在进化 上高度保守，由于人类与小鼠问的同源性很高，Pax6突变小鼠或Pax6基因敲除小鼠已成为研究Pax6的重要工具 糖尿病的基因诊断 演讲：冯永恒 ppt制作：李天爽 资料搜集：孙阳、朱永翔、黄轶洲、杨汉 基因诊断（gene diagnosis ） gene diagnosis is also called DNA molecular diagnosis, through the use of molecular biology and molecular genetics technology, direct detection of the molecular structure level and the expression level is abnormal, thus to judge disease. 基因突变 INS INSR mt GluT GCK 基因突变 线粒体DNA基因突变 糖尿病中mtDNA缺陷主要有两种类型，包括点突变和基因重排（大片段的缺失和重复）。 线粒体基因突变糖尿病的诊断 筛查诊断人群 基因诊断 基因诊断方法 1.点突变 （1）对已知的mtDNA点突变筛查 ①酶切法 用聚合酶链反应—限制性片段长度多态性分析（RFLP）技术，其中常用ApaⅠ酶切，HaeⅡ酶切，MscⅠ酶切技术； 过程： 1．提取基因组DNA样品进行处理 2．PCR 3．酶解 4．凝胶电泳 5 ．呈色 ②非酶切法 等位基因特异引物PCR扩增技术 （2）对未知的mtDNA点突变筛查 ①聚合酶链反应—单链构象多态性技术； ②异源双链分析及DNA序列测定； ③不连续相低严谨单个特异引物PCR筛查。 2.mtDNA重复、缺失 ①用PVUⅡ、XhoⅠ酶等水解总DNA后用线性mt DNA行Southern杂交初筛； ②引物移动PCR技术； ③家系内筛查缺乏患者可用WISP—PCR法。 2型糖尿病患者家系图 含mtDNA 7444位点的PCR产物的限制性内切酶酶切结果 部分含mtDNA 7444位点的PCR产物测序的结果 胰岛素基因突变 应用聚合酶链反应—单链构象多态性(PCR—SSCP)及等位基因特异性寡核苷酸斑点杂交技术对INS基因进行分析，发现有Arg65→His、Arg65→leu以及Hisl00→Asp等点突变。此3种突变均可导致血中胰岛素原不能转换为胰岛素，从而引起高胰岛素原血症。 胰岛素基因突变可以导致异常胰岛素病、永久性新生儿糖尿病( PNDM) 、青少年成人起病型糖尿病( MODY) 以及部分自身抗体阴性的1 型糖尿病。 用分子生物学的实验方法对非胰岛素依赖 型糖尿病NIDDM患者的胰岛素进行检测， 从NIDDM患者外周血的白细胞中提取DNA 以胰岛素基因5’-末端上游的某一DNA序列 为引物，对特定的靶序列进行体外扩增， 即Tap DNA聚合酶链式反应（PCR），将 其扩增产物进行电泳分离，在紫外分析仪 下观察结果并与正常人对照，发现NIDDM 患者的胰岛素基因有所改变。 实验 结果与分析 实验结果如图，9、18号为正常人对照，1-8,10-17号为NIDDM患者（16、17号为同卵双生姐妹），电泳结果发现正常人胰岛素基因为两条区带，NIDDM患者的胰岛素基因出现3-4条区带。 糖尿病相关基因的基因诊断技术 1.C?肽释放试验? 2.聚合酶链反应一单链构象多态性分析 (PCR-SSCP)? 3.变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE） C?肽释放试验? 原理：C?肽是胰岛β细胞的分泌产物，?它与胰岛素有?一个共同的前体——胰岛素原。?一个分子的胰岛素原在特殊的作用下，裂解成一个分子的胰岛素和一个分子的?C?肽，因此在理论上?C?肽和胰岛素是等同分泌的，血中游离的?C?肽生理功能尚不很清楚，但?C?肽不被肝脏破坏，?半衰期较胰岛素明显为长，故测定?C?肽水平?更能反应β细胞合成与释放胰岛素