B、C基因型乙型肝炎病毒调控元件活性差异及机制地研究.pdf

万方数据 目 录 摘 要 1 Abstract 2 前 言 4 第一部分 B、C 基因型HBV 调控元件保守序列的确定及报告质粒的构建 6 引 言6 材料与方法 7 结 果 20 讨 论 27 小 结 29 第二部分 B、C 基因型HBV 调控元件活性的比较分析 30 引 言30 材料与方法 31 结 果 35 讨 论 39 小 结 41 第三部分 B、C 基因型HBV 增强子Ⅱ活性差异机制的初步研究 42 引 言42 材料与方法 43 结 果 51 讨 论 61 小 结 64 结 论 65 参考文献 66 附录一 英文缩略词表 73 附录二 试剂配方 75 附录三 主要仪器设备 78 致 谢 79 综 述 80 乙型肝炎病毒转录调控元件的研究进展80 参考文献 88 万方数据 B、C 基因型乙型肝炎病毒调控元件的活性差异 及机制研究 摘 要 尽管安全有效的疫苗应用至今已有近三十年，但乙型肝炎病毒的感染仍然是全球重 大的公共卫生问题之一。基于HBV 基因组序列的差异目前将其分为A~J 十个基因型， 我国是HBV 感染的高发区，广泛分布的主要是B 和C 两种基因型。研究发现B 、C 基 因型HBV 感染者在病毒学、临床表现及对干扰素的反应方面存在较大差异。但目前为 止引起B 、C 基因型HBV 表现差异的具体机制尚未完全阐明。 HBV 全长3.2kb，其调控元件包含C、S1、S2 与X 四个启动子以及EnhI 和EnhII 两个增强子。鉴于HBV 调控元件对其复制、转录及蛋白表达的重要调控作用，我们通 过对B 、C 基因型HBV 调控元件的活性进行比较分析，以期找出两个基因型表现差异 的原因及机制。 本研究第一部分通过对B 、C 基因型HBV 序列进行同源分析，分别获得这两个基 因型HBV 基因组的保守序列。之后以本实验室保存的病毒株作为模板进行调控序列的 扩增，并将差异位点序列突变为保守序列，成功构建了B 、C 基因型保守的HBV 各调 控元件的萤火虫荧光素酶报告质粒，为后续研究奠定了基础。 第二部分通过比较B 、C 基因型保守的HBV 各调控元件的活性发现Xp-EnhI、Xp 、 及BCp 活性B 、C 基因型间无统计学差异，Cp-EnhII、Cp 及SpI 活性B 型高于C 型， 而SpII 活性B 型低于C 型。随后通过对SpII 进行B 、C 基因型3’端置换发现两个区域 对SpII 活性均有较大影响。 第三部分通过比较证实B 、C 基因型HBV EnhII 活性确实存在差异，并在B 型EnhII 序列中进行四个C 型序列突变，发现1635-1640 与1654 位点对B 、C 基因型EnhII 活性 差异起重要作用。随后通过凝胶迁移阻滞实验初步鉴定出细胞内存在与B 型1635-1640 位点结合的核蛋白，并通过DNA pull down 筛选以及质谱鉴定获得PARP1 、SFPQ、NonO 、 Ku70 及Ku80 五个候选结合蛋白。我们的结果表明转录因子与EnhII 1635-1640 位点的 结合及对其活性的影响可能是B 、C 基因型HBV 表现差异的一个重要机制。 关键词：乙型肝炎病毒，基因型，增强子，启动子 1 万方数据 Comparison of the different activities of genotype B and C hepatitis B virus regulatory element