PCR技术及其应用(全).ppt

PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 模板不纯 Buffer不合适 退火温度偏低 酶量过多 dNTP、Mg2+浓度偏高 循环次数过多 原因 对 策 纯化模板 更换Buffer 适当提高退火温度 适量用酶 适当降低dNTP和镁离子的浓度 减少循环次数 拖尾 6、PCR污染及防御措施 （1）潜在的污染源 患者、操作人员身体表面，实验室器材、试剂、仪器等。 （2）措施： 分区操作，经常消毒 做好器材、试剂的灭菌 使用一次性的Tip头、反应管 小量分装，避免相互污染 戴手套操作 器具专用 设立阳性对照和阴性对照 （3）污染源的处理 稀酸或84消毒液处理 紫外线照射 反应液污染的处理 7、RT-PCR中避免核糖核酸酶的污染 （1）外源RNase：戴口罩、手套；玻璃器具用0.1％的DEPC处理；器材用一次性用品；所有溶液用DEPC处理水配制 （2）内源RNase：使用RNase抑制剂；去除蛋白质 五、Type and Application of PCR 1.Reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR Question: 以DNA为模板进行PCR得到的结构基因由外显子和内含子组成，内含子在后续的分析中会带来很多不便，怎么办？ 基因 mRNA 蛋白质多肽链 逆转录病毒细胞内的逆转录现象: RNA 模板 逆转录酶 DNA-RNA 杂化双链 RNA酶 单链DNA 逆转录酶 双链DNA 二步法RT-PCR gene specific primer oligo(dT) primer random hexamter primer cDNA synthesis PCR Amplification 二步法RT-PCR 一步法RT-PCR 两步法与一步法RT-PCR比较 逆转录酶的选择 Applications ① 获得基因完整编码区序列： ② 检测基因转录产物： ③ 制备用于杂交的cDNA探针： ④ 选择性剪接转录物的检测： ⑤ 5’端和3’端序列的快速克隆。 选择性剪接 2.inverse polymerase chain reaction, IPCR 反向PCR Question: 常规PCR技术用于扩增已知序列之间的DNA片段，对于已知序列侧翼的未知DNA序列的扩增则毫无办法，如果要研究侧翼序列，比如转座子，启动子等，怎么办？ Inverted PCR A A B A B A Steps: * Cut with enzyme * Cyclization * Amplify to get sequence unknown sequence unknown Applications ① 用IPCR克隆连续的基因组DNA大片段： 可无限制地克隆侧翼的序列，可应用于基因组 测序；如，是“鸟枪法”测序的重要补充。 ② 获得启动子序列： ③ 定点诱变DNA: ④ 鉴定插入失活基因： 3. asymmetric polymerase chain reaction, 不对称PCR Question: 常规PCR技术得到指数扩增的双链DNA， 想得到单链DNA（ssDNA），怎么办？ a. 引物浓度不对称PCR reaction system ： 10×buffer 2.5ul template 2ul 限制性引物 0.5pmol 非限制性引物 50pmol dNTP 1ul Taq酶 2u（2ul） 双蒸水补齐至 25ul Caution: 限制性引物：非限制性引物 1