土壤中反硝化菌分离其反硝化能力分析及研究.docVIP

土壤中反硝化菌的分离与其反硝化能力的分析研究 上海交通大学附属中学 高二（9）班 姜北辰2011-2 目录 绪论 实验材料及方法 结果与数据分析 分析总结与讨论 参考文献 摘要： 通过对土壤样本进行初筛和复筛，以限制氮源的方法分离出8株具有反硝化能力的微生物，对5株微生物的反硝化能力进行测定，其二周时间硝酸盐降解率最高为100%，最低为66.76%。对此8株菌株的DNA进行PCR扩增，引物为已知的nirS和nosZ反硝化基因的相应引物，发现有三株菌株含有nosZ基因。再对此8株菌株中的7株的16S rDNA进行PCR扩增，鉴定菌种。 关键词：反硝化微生物，菌种鉴定，反硝化菌筛选 绪论： 反硝化作用（denitrification）也称脱氮作用。反硝化细菌在缺氧条件下，还原硝酸盐，释放出分子态氮（N2）或一氧化二氮（N2O）的过程。大部分反硝化细菌是异养菌，例如脱氮小球菌、反硝化假单胞菌等，它们以有机物为氮源和能源，进行无氧呼吸，其生化过程可用下式表示： C6H12O6+12NO3-→6H2O+6CO2+12NO2-+能量 CH3COOH+8NO3-→6H2O+10CO2+4N2+8OH-+能量 反硝化作用使硝酸盐还原成氮气，从而降低了土壤中氮素营养的含量，对农业生产不利。农业上常进行中耕松土，使土壤与氧气充分接触以防止反硝化作用。反硝化作用是氮素循环中不可缺少的环节，可使土壤中因淋溶而流入河流、海洋中的NO3-减少，消除因硝酸积累对生物的毒害作用。所以我们应尽量发挥其有利的一面，为人类所利用。 反硝化微生物对于硝酸根离子的还原步骤如右图，若要从微生物代谢角度验证菌株是否为反硝化菌最简单有效的方法便是测定nirS和nosZ基因是否存在。由于 N2O和NO都是温室气体，是否含有nosZ基因对于菌种的用途有着实际且重要的意义，即可以使土壤中微生物代谢产生的N2O和NO还原成氮气[1]。本实验的目的便是通过筛选土壤中的反硝化菌，测定反硝化能力，鉴定其是否含有nirS和nosZ基因，对此进行综合分析，找出反硝化能力较强的菌株，最终制备纯培养的反硝化菌菌株。实验完成后，此菌株将有十分广大的应用前景。例如，将对农田等生态系统中其他微生物产生的N2O和NO等温室气体还原，减少温室气体的排放，为维持环境的稳定起到积极作用。 实验材料与方法 LB液体培养基 (每1000ml) 10g蛋白胨 5g酵母提取物 10g NaCl 若加入15g琼脂粉则为LB固态培养基成分。 TSA培养基： 胰蛋白胨0.75g/L 大豆胨 0.25g/L NaCl 0.25g/L Giltay培养基 A溶液：KNO3 1.0g。天冬酰胺1.0g，1%BTB酒精溶液5mL，蒸馏水500mL B溶液：柠檬酸钠8.5g， MgSO4·7H2O 1.0g，FeCl3·6H2O 0.05g，KH2PO41.0g，CaCl2·2H2O 0.2g，蒸馏水500mL 混合A、B溶液，加入1%mol/L的NaOH溶液调节pH为7.1，灭菌备用。 琼脂糖凝胶电泳 全基因组电泳： TAE buffer 30ml 琼脂糖0.8%（0.24g） PCR产物电泳： TAE buffer 50ml 琼脂糖1.2%（0.6g） 均加入荧光剂EB 1微升 Bead-Beater法所用试剂 bufferZ ：10mM Tris-HCl, 150mM NaCl, pH 8.0 (1.21g Tris碱，8.755g NaCl, 加HCl调至pH 8.0, 配成1L溶液) 10%SDS(C12H25OSO3Na)100g溶于1L水 pH 5.3 氯仿-异戊醇（24：1） 苯酚（pH 8.0） 无水乙醇 Eirconium beads Screw tube PCR反应体系(25μl) 10×buffer 2.5μl Taq酶 0.25μl MgCl2 2μl dNTP 2μl primer1 0.5μl primer2 0.5μl 水 16.25μl 模板 1μl nosZ nirS primer1 nosZ F R3cd primer2 nosZ R cd3aF 修正PCR反应体系（50μL） 10×buffer 5μL Taq酶 1μL dNTP 7μL primer1 1μL primer2 1μL 模板 1~2μL