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γ-氨基丁酸（GABA）的分布及测定方法 周青 2110805057 生物化工 导师：汪钊教授 目录 分布 γ-氨基丁酸（GABA）含量的测定方法 薄层色谱 纸电泳法 纸层析法 比色法 氨基酸分析仪测定 毛细管电泳-电化学检测 高效液相色谱法 归纳和总结 分布 在动物体内，GABA主要分布于神经组织中，在哺乳动物的脑组织内分布最为集中，其含量是单胺类含量的1000倍，而在外围器官中含量很少。在植物体内，GABA是细胞自由氨基酸库的重要组分，胞液中有几种构型，可形成类似脯氨酸的环状结构。高等植物组织中GABA含量通常在0.3～32.5μmol／g之间，超过许多蛋白质类氨基酸的含量。 方法：展开剂是正丁醇：醋酸：水=4：1：1。分别吸取5μl γ-氨基丁酸标准品溶液和样品洗脱液，点于自制的硅胶薄层板上， 以正丁醇：醋酸：水体积比为4：1：1为展开剂展开，取出晾干，用体积分数0.2％茚三酮乙醇溶液显色，105℃烘数分钟，直至获最大斑点，用Camag TLC scanner 3 扫描仪扫描。扫描条件为：反射式双波长锯齿扫描,扫描波长λS=515nm,参比波长λR=680nm，狭缝50×0.45 mm。 纸电泳法 方法：取上清液用于点样于滤纸上，以标准GABA溶液做对照，在电压300V、室温条件下电泳60min，电泳缓冲液为吡啶-冰醋酸混合溶液[吡啶：冰醋酸：蒸馏水(体积比)=2：2：121，pH4.7]。电泳完毕后取出电泳纸，水平摆放，室温下自然晾干，再在80℃电烘箱中风干。用喷雾法向电泳纸上均匀喷洒显色剂，于电热恒温干燥箱中90℃烘10 min，即显出在有氨基酸区域呈紫红斑点的层析图谱。将与GABA标准品位置一致的斑点剪下，加4ml洗脱液[洗脱液V(0.1％硫酸铜溶液):V(75％乙醇溶液)=1:19]洗脱90min，在520nm波长处比色测定洗脱液的吸光度。 纸层析法 方法：展开剂V(正丁醇)：V(醋酸)：V(水)=4：1：3，茚三酮溶解于展开剂中，质量浓度为0.4g/L，在展开过程中，茚三酮随着展开剂沿滤纸向上移动。点样后的滤纸条在展开剂中展开、风干显色，将与标准品位置一致的斑点剪下，用洗脱液[V(1 g／L硫酸铜)：V(体积分数75%乙醇)=2：38]洗脱，520nm处比色测定。 比色法 方法：先做GABA标准曲线：取不同浓度的GABA标准液0.4ml，加0.2mol／L(pH 9.0)硼酸盐缓冲液0.6 mL，摇匀，加5%苯酚溶液2mL，摇匀，加质量分数6%次氯酸钠溶液1mL，摇匀，放人沸水浴加热5min，立即置冰浴中5min，待溶液出现蓝绿色后，加入2.0mL60％酒精，进行波谱扫描，在最大吸收峰处测定溶液的吸光度，以吸光度为纵坐标，GABA的含量为横坐标，绘制标准曲线。把处理的样品按以上方法测吸光度，求出样品中GABA的含量。 氨基酸分析仪测定 方法：以日立835—30型氨基酸分析仪为例，先按仪器说明配制缓冲溶液及茚三酮溶液，标准GABA溶液用0.02mol／L盐酸配制成不同浓度，测得峰面积，绘制标准曲线。把处理的样品按以上方法峰面积，求出样品中GABA的含量。 张华和何轶通过此方法测得南瓜中GABA含量为2.956%和沙棘果汁GABA含量为13.4mg/100ml。Chen和Komatsuzaki也采用氨基酸分析仪检测发酵牛奶中GABA含量和发芽糙米经过浸泡和厌氧处理后GABA含量，结果显示用乳酸菌发酵的牛奶和发芽糙米处理后GABA含量为80.6mg/ 100g 和24.9 mg/100 g。 毛细管电泳-电化学检测 该方法使用比较少。孔令瑶用亚硫酸钠替代硫醇试剂使GABA与OPA反应，生成稳定具有电化学活性的衍生物，然后采用毛细管电泳-电化学检测(CE—ED)法测定发芽黑米胚芽中GABA的含量。他以自制碳圆盘电极为工作电极，以50mmol／L的硼砂-硼酸缓冲液为运行缓冲液，采用电动进样，检测池为阴极电泳槽。 高效液相色谱法 γ-氨基丁酸与邻苯二甲醛(OPA)衍生 γ-氨基丁酸与2，4-二硝基氟苯（FDNB）衍生 γ-氨基丁酸与异硫氰酸苯酯(PITC)衍生 γ-氨基丁酸与6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚氨基甲酸酯（AQC）衍生 γ-氨基丁酸与邻苯二甲醛(OPA)衍生 葛菁萍利用邻苯二甲醛柱前衍生高效液相色谱法定量测定短乳杆菌发酵液中γ-氨基丁酸含量，利用C18色谱柱，以50mmol／L的乙酸钠(pH6.8)-甲醇-四氢呋喃(A相，82：17：1；B相，22：77：1，V/V)为流动相进行梯度洗脱，可以检测到痕量γ-氨基丁酸(2．2mg／100g)。 γ-氨基丁酸与2，4-二硝基氟苯（FDNB）衍生 孟祥勇采用2，4—二