《电泳问题解决方案（二零一六年）》.doc

电泳问题解决方案 Example 1“Smearing”，导致拖尾效应有很多的原因，最终要的是丙烯酰胺灌制的不够均匀和样品量过大！这是当时学生制胶时底下已经凝固，然后再重新补上一部分的浓缩胶和分离胶所致！当然重叠在一起，无法区分也是难免了。Example 2样品量过大而出现了样品“交叉”污染，正常的当载样在20 to 40 micrograms/well 将会很漂亮。Example 3样品量过大，当然胶灌制的也不够均匀。由于过量的样品影响了个别泳道的电场，使的有些条带宽，有的窄些。Example 4“Smearing”（注意泳道4），这可能和样品中的含有大量脂类的膜相关蛋白引起的：由于不连续的胶中，样品被浓缩的很厉害。所有样的迁移速率在样品过积层胶后都会慢下来，当到达分离胶时，PH的改变使得聚集的膜相关蛋白有沉降的倾向，但另一个方面，电泳过程又不断的溶解这些蛋白，因此便出现了泳道4中连续的黑色托尾，通过WESTERN验证后，这些都是一个组分造成的！Example 5这张还不是太糟糕。泳道4还加上飞纹，原因是样品未能处理好，上样量控制的也不够好，另外跑的过程可能电压过大；另外这张胶当时做的时候，分离胶凝固的并不是很好，蛋白穿过胶孔时，浓度并不均一，因此形成了飞纹而不是一片黑色托尾。由于样品跑的比较直且齐整，因此电场还是比较均匀的。泳道5中的蛋白没有很好的溶解。Example 6简直一塌糊涂！首先做好分离胶时，没有封闭。另外，样品很快的沉降到不平整的脚面上，随着电泳的进行，样品不断的融解，以至形成托尾而不是一条条清洗的条带。另外，这个样品可能含有杂质比较多（不溶性杂质或基因组DNA），可见上样前的充分离心也是必要的!Example 7条带太淡。背景脏且不够均匀，说明电泳缓冲液有污染（杂质在电泳过程中不断的进入胶中），或者板子没有洗干净。在溴芬兰线的后面还有连续的细线，说明上样不够小心，致使样品飞了出孔，同时也污染了其他的相临样品。Example 8 完全是染液重复利用惹的祸，对于这张（只有下面着色），只要重新再染，效果还是可以的。Example 9这是一张银染的结果。本来一切都小心奕奕的，结果把胶放到去离子水中回家了，过了一夜，第二天染色结果变成这个样子了，呵呵~~原因：固定在胶中的蛋白都溶到水里了。Example 10电泳停的太早。如果能继续再跑，效果就好了，当然，缓冲液必须有足够的缓冲能力，否则会引起扩散。Example 11这张图大家最主要的看看是胶孔作的不够齐整（我用箭头标出了）。另外，可能由于选用旧的上样缓冲液，致使2-mercaptoethanol 挥发，电泳的样品没有完全处于变性状态下，这使得跑出的结果难以很好预测。Example 12 胶的浓度过大（不是自己的，浪费也不心疼），只有少量的小分子蛋白能入胶；由于胶的浓度过大，聚合不够均匀，载样过大，出现上面的情况自然是必然的了！Example 13可能由于选用旧的上样缓冲液，还原试剂已经挥发，另外缓冲液中SDS的量也应该稍微的补加（可能有析出），样品根本无法进入胶中。只有让分离的蛋白入胶，才能进行良好的分离。Example 14要么样品盐浓度过高，要么分离胶不均匀。因此应该把部分样品中的盐透洗除去，或者一直采用较小的电流来跑，可能效果会稍微的好一点点。当然，根本的还是应该去盐份（如果重复结果一致的话）。Example 15做的好图。 SDS是蛋白质及核酸分离中的常用技术，其质量的好坏往往对后续操作具有决定性的影响，这个专题也许并不能带给你完整的SDS技术的理论体系，也不能告诉你怎样制备一块完美的凝胶，但是，它通过实例告诉你什么是错误的，我们应该怎样去改进，我想这往往是我们最需要的...这个专题是一个译本，来自于Rice大学的网站，/~bioslabs/studies/sds/sdsgoofs.html，我看过很多遍，觉得非常有用，因此也就萌生了将此翻译为中文，供大家方便的浏览，鉴于本人的英语水平有限，译文中如有错误望各位战友不吝指出，谢谢！我也非常希望能够借此帖引起大家对SDS中的问题进行反思，共同讨论您在SDS中遇到的问题及解决方案，争取在这里建立一个SDS问题凝胶的图像库。OK，lets goSDS“hall of shame”如果你能够非常熟练的制备一块完美的凝胶，甚至对它进行改进都十分困难，那么你真的应该值得庆幸！但是如果你不能达到这个水平也不要灰心。所有的优秀的科学家都是从失败中成长起来的，事实上，如果不出错我们就很难学到更多的东西！（我的western blot技术也是从上百次的失败中成熟起来的，这中间我就学到了很多，相对于PCR，我第一次就成功的做出了RT-PCR和重叠延伸PCR，