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本文观看结束！！！ 5-Aza-CdR对人食管癌细胞株生物学行为及TFPI-2 mRNA表达的影响 1.4　流式细胞仪(FCM)检测干预前后细胞凋亡率的变化 取对数生长期细胞，按5×105/mL的密度接种于6孔板内，待细胞贴壁后加药，分组如下：对照组(0 μmol/L),1.6 μmol/L 5-Aza-CdR组，25.6 μmol/L 5-Aza-CdR组，102.4 μmol/L 5-Aza-CdR组。每组均于5-Aza-CdR作用48 h后消化收集细胞，700 mL/L冰乙醇固定，流式细胞仪进行细胞凋亡测定。 1.5　RT-PCR技术检测TFPI-2基因mRNA的表达 分组同FCM，每组细胞均5-Aza-CdR作用48 h。TFPI-2的上、下游引物分别为5′-GTCGATTCTGCTGTTTTCC-3′和5′-ATGGAATTTTC TTTGGTGCG-3′，合成产物为440 bp;β-actin作为内参照，上下游引物分别为5′-AGGCATTGTGATGGACTCCG-3′和5′-AGTGATGACCTGGCCGTCAG-3′，合成产物为301 bp。按照试剂盒说明书，用Trizol试剂提取细胞总RNA，经紫外分光光度计分析后，按Sigma公司RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit说明书操作。先逆转录制备单链cDNA，再以逆转录产物为模板，用上、下游产物进行PCR反应扩增目的基因。反应条件为：94 ℃预变性3 min，然后94 ℃变性30 s,51 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s，循环30次，最后72 ℃延伸5 min,4 ℃保温。扩增片段经20 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。 1.6　免疫组化方法检测TFPI-2蛋白的表达 取对数生长期细胞，按5×104/mL的密度接种于经预处理的盖玻片上，待细胞贴壁后加药(分组同RT-PCR)。培养48 h后加入40 g/L多聚甲醛溶液固定30 min,30 mL/L H2O2封闭内源性过氧化物酶，室温下10 min,100 mL/L动物血清封闭，室温下10 min，滴加1∶100的稀释的TFPI-2抗体4 ℃过夜，二抗室温下1 h，滴加辣根酶标记链霉卵白素，37 ℃孵育30 min，DAB显色，苏木精复染，脱水透明封片。另取爬片滴加PBS 液代替一抗作为阴性对照。结果判定：TFPI-2蛋白阳性信号均呈棕黄色颗粒样物质，位于细胞质内。光镜下随机选取10个视野(每个视野观察细胞数不少于100个)，按阳性细胞所占百分比进行结果判定。阳性率=(阳性细胞数/1 000)×100%。 1.7　统计学处理 应用SPSS16.0软件进行统计学处理。实验数据采用均数±标准差(x-±s)表示，采用单因素方差分析加LSD两两比较法进行分析。检验水准α=0.05。 2　结　　果 2.1　干预前后细胞增长率的变化 经MTT检测，结果显示，实验组细胞抑制率明显高于未加药组，且随着作用时间的延长和浓度的增加而增加(表1)。表1　不同浓度的5-aza-CdR对Eca9706细胞增殖的影响 2.2　干预前后细胞凋亡率的变化 流式细胞仪分析可见，经不同浓度5-Aza-CdR诱导48 h后，Eca9706细胞各处理组凋亡率分别为(13.76±0.47)%、(26.97±0.39)%、(41.03±0.19)%，与5-Aza-CdR诱导浓度成正比。与对照组[(1.39±0.27)%]比较差异有统计学意义(P0.05)，且各浓度组间比较差异亦有统计学意义(P0.05，图1)。以上实验重复5次。 2.3　干预前后Eca9706细胞mRNA的表达情况 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳显示，Eca9706细胞中TFPI-2 mRNA表达在各用药组和未用药组之间有明显差异，TFPI-2 mRNA在未用药组细胞中未见表达。经1.6、25.6、102.4 μmol/L 5-Aza-CdR处理后可见TFPI-2 mRNA表达，表明在一定范围内随5-Aza-CdR药物浓度的增加TFPI-2 mRNA表达逐渐增强(图2)。图1　各组流式细胞凋亡散点图A：对照组;B：1.6 μmol/L 5-Aza-CdR组;C：25.6 μmol/L 5-Aza-CdR组;D：102.4 μmol/L 5-Aza-CdR组。图2　5-Aza-CdR处理前后Eca9706细胞TFPI-2 mRNA的表达　M：DNA marker;β-actin：301 bp;TFPI-2：440 bp;1：对照组;2：102.4μmol/L组;3：25.6 μmol/L组;4：1.6 μmol/L组;5：H2O对照