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目前所用测序技术的缺点 ? 测序的原理是DNA链终止法，这注定了一个反应所 测序列不可能太长，目前为1000个核苷酸左右。 ? 测序反应费时费力 科学家们完成第一个人类基因组测序整整花了13年的 时间，耗费了30亿美元的费用。 ? 测序准确度不高 DNA聚合酶造成的碱基错配，DNA序列判读错误。 测序基于PCR反应，需要引物，并且有些结构复杂 的难于进行PCR反应的片段不能测序。 DNA测序技术的应用 ①PCR克隆测序验证 ②新基因测序 ③基因定点诱变的基础,突变体检测 ④全基因组测序 ⑤系统发育及物种鉴定 简 介 DNA 测序原理及实验过程 发展中的DNA测序技术 DNA 测 序 技 术 的 应 用 简介 DNA测序技术即测定核酸DNA分子一级结构的技术。 1975年Sanger和Coulson发明了“加减法”测定DNA 序列。 1977年在引入双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）,形成了 双脱氧链终止法，使得DNA序列测定的效率和准确性 大大提高。Maxam和Gibert也在1977年报道了化学降 解法测定DNA序列。DNA序列测定技术出现后，迅速 超越了蛋白质和RNA测序技术，成为现代分子生物学 中最重要的技术。 DNA测序原理 ? Sanger双脱氧链终止法 ? Maxam-Gilbert DNA化学降解法 利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。终止点由反应中相应的双脱氧核苷酸而定。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。 双脱氧链终止法 读出模板互补序列 dNTP 凝胶电泳 较大片段 较小片段 ddGTP ddATP ddCTP ddTTP 反应混合物 Klenow酶 未知序列的单链DNA 读出待测序列 CTGACTTCGACAAAGAA 5′ 3′ A C T G ddG ddG ddG ddG GACTGAAGCTGTT 3′ 5′ CTGACTTCGACAA 5′ 3′ 双脱氧链末端终止法测序基本原理示意图 一个末端标记的DNA片段在几组互相独立的化学反应分别得到部分降解，其中每一组反应特意地针对某一种或某一类碱基。因此生成一系列放射性标记分子，从共同起点（放射性标记末端）延续到发生化学降解的位点。每组混合物种均含有长短不一的DNA分子，其长度取决于改组反应所针对的碱基在原DNA全片段上的位置。此后，各组均通过聚丙烯凝胶电泳进行分离，再通过放射自显影来检查末端标记的分子。 DNA化学降解法 实验过程 一、 试剂与器材 1.试剂 (1)退火缓冲液：1mol/L Tri-HCl(pH7.6)，l00mmol/L MgCl2和 160mmol/L DTT。 (2)通用测序引物：5’-d[CGTAAAACGACGGCCAGT]-3’， 在水溶液中(5pmol/μl)。 (3)T7DNA聚合酶(8ug/μl)：在加有甘油的缓冲液中,应储于-20℃， 用时吸取1份后迅速放回。稀释液可在4℃保存l周。 (4)酶稀释缓冲液：20mmol/L Tris-HCl(pH7.5)，5mmol/L DTT， 100 u g牛血清白蛋白/m1，5%甘油。 (5)标记用混合物(Labelling Mix)：dCTP，dGTP和dTTP各1.375μm， 333.5mmol/L NaCl。 (6)模板：l0μg单链M13mpl8DNA在50μ1Tris-EDTA缓冲液中。 (7)“A”mixshort：dCTP，dGTP和dTTP各840μmol/L，93.5μmol/L dATP，14μmol/L ddATP，40mmol/L Tris-HCl (pH7.6)，50mmol/L NaCl (8)“Gmixshort；dATP，dCTP和dTTP各840μmo