湖北省黄瓜绿斑驳花叶病毒、番茄黄化曲叶病毒的检测及其分子鉴定.pdf

  摘 要 新的植物 RNA/DNA 病毒病的出现和流行是目前世界农业领域面临的最大威 胁之一。 近年来，世界范围内新发现了 20 多种新的危险性病毒，黄瓜绿斑驳病毒和番 茄黄化曲叶病毒就是植物病毒中的典型代表。 本研究主要开展了 CGMMV （Cucumber green mottle mosaic virus ，CGMMV ） 以及TYLCV （Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV ）的鉴定以及分子序列分析等 研究工作，为 CGMMV 和 TYLCV 的快速诊断提供一定的理论和技术依据。 主要实验结果如下： 以湖北省武汉市的多种葫芦科作物以及禾本科叶片为材料，设计并合成扩增 外壳蛋白序列引物，通过 RT-PCR 方法检测，在该地区西瓜，南瓜以及玉米病叶上 检测到黄瓜绿斑驳花叶病毒。 在对 RT-PCR 反应体系及扩增程序进行了优化的基础上，建立了 One Step RT-PCR 方法，将分离物扩增得到的 CP (Coat Protein)基因进行 T-A 克隆，经核苷 酸序列分析结果表明，该分离物 CP 基因全长为 486bp ，编码 161 个氨基酸，理论 分子量为 17.3kDa 蛋白，与国内外已经报道 CGMMV 的 CP 基因相比，其核苷酸 序列的平均同源性为 98.2%，具有很近的亲缘关系。 番茄黄化曲叶病毒属烟粉虱传双生病毒，根据其外壳蛋白(Coat Protein, CP)基 因保守序列设计并合成一对简并引物，对采集到的番茄上疑似病例进行 PCR 检测， 经扩增获得一条约 500bp 的DNA 片段，并将扩增产物连接到 pMD18-T 载体上进 行测序鉴定。经测序和序列比对，结果表明湖北省感病番茄上发生的病毒是番茄 黄化曲叶病毒，并且同其他地区病毒核苷酸序列的同源性达 95%-99% 。全序列测 定表明，DNA-A 全长为 2781bp ，是一个伴随有卫星DNAβ的单组份双生病毒。 依据快检缓冲液筛选重组子克隆的方法，结合碱裂解法提取质粒DNA 的原理， 经过试验摸索，应用了快检缓冲液直接裂解菌液，电泳后筛选重组质粒的方法， 避免了提取质粒鉴定等繁琐步骤，其结果与菌液 PCR 、质粒酶切鉴定结果一致，   可以快速筛选出重组克隆。 关键词：黄瓜绿斑驳花叶病毒；番茄黄化曲叶病毒；外壳蛋白基因；RT-PCR ；序 列分析     Abstract The new plant RNA/DNA virus have emerged and epidemiced are one of the biggest threat for the world agricultural fields. In recent years，the worldwide have found more than twenty new risk virus ， Cucumber Green Mottle Mosaic Virus and Tomato yellow leaf curl virus were the typical representative. In this study，methods of identification and molecular detection of CGMMV and TYLCV were developed，the results can provide reference for quarantine department. Major results are described as follows ： A pair of primers were des