利用高分辨熔解曲线分析技术快速检测鉴定四种临床常见侵袭性曲霉菌的方法学的研究.pdf

1111 1 11111 IIII IIII III Y2257071 利用高分辨熔解曲线分析技术快速 检测鉴定四种临床常见侵袭性 曲霉菌的方法学研究 硕士研究生：曹楠楠 指导教师：王前 摘要 侵袭性真菌感染是免疫力低下病人不得不面临的严峻挑战。近些年，肿瘤， 艾滋病，器官移植等免疫低下病人的侵袭性真菌感染率不断上升，且死亡率极 高。 临床上侵袭性真菌感染的常见病原多为念珠菌属，但隐球菌尤其是新生 隐球菌，丝状真菌尤其是曲霉菌属等条件致病性真菌感染的发生近年来也呈逐 年上升趋势。对于这些感染的临床治疗而言，治疗效果很大程度上取决于病人 的免疫力状况及能否及时给与准确有效的抗真菌药物。目前临床上常用的抗真 菌药物主要有两性霉素B，酮康唑，氟康唑，泊沙康唑、卡泊芬净等。有文献报 道，临床上分离到越来越多的对唑类抗真菌药物和两性霉素B耐药的曲霉菌株， 因此有必要研究一种能够快速检测鉴定临床常见曲霉菌的方法，为临床进行更 有效的侵袭性曲霉菌感染治疗提供参考。 高分辨熔解曲线分析技术的基本原理是在PCR完成后，升高PCR体系温度， 利用双链DNA饱和荧光染料，实时监测升温过程中双链DNA饱和荧光染料与 体系中DNA双链的结合情况(仪器上反映为荧光信号的变化)，达到DNA双链 序列分析的目的。双链DNA饱和荧光染料的结合原理与传统的荧光定量PCR Green等属于不饱和荧光染料，体系中此种 染料不同。传统的荧光染料如Sybr 荧光染料存在对PCR反应有抑制作用，因此在体系中加入的不饱和荧光染料浓 中文摘要 度很低，远远低于产物DNA双链结构中染料结合位点的数目，DNA双链结构 中存在大量的空余荧光染料结合位点。PCR过程完成产生大量的产物DNA双链， 荧光染料分子结合在产物DNA双链上的染料结合位点。随着体系温度逐渐升高， 体系中的DNA双链开始变性解链，荧光染料分子逐渐离开DNA双链结合位点， Green等不饱和荧光染料分子在离开DNA双 反映为荧光信号的逐渐降低。Sybr 链的过程中会发生分子结合位置的重排，因DNA解链而离开的不饱和荧光染料 分子会迅速重新结合到尚未解链的其他双链部分上空余染料结合位点，荧光信 号的变化失真，不能准确反映体系内DNA双链的解链情况。而饱和荧光染料如 LCGreen等对PCR反应基本无抑制作用，PCR体系中荧光染料的添加量远远高 于体系中DNA双链上的染料结合位点数目，DNA双链上不会存在空余的染料 结合位点，解链过程中能够最大程度上减少染料分子重排。体系温度升高，体 系中DNA双链变性解链，饱和荧光染料分子与解链的DNA双链解离，因其他 尚未解链的DNA双链上不存在空余结合位点，解离的染料分子不会重新结合到 双链DNA上，荧光信号的变化能够真实反映体系中双链DNA的解链情况，使 利用熔解曲线进行序列分析成为可能。 PCR)顾名思义，不对称PCR方法中两 不对称PCR扩增技术(asymmetric 种引物的量相差悬殊，通常l：5～1：100不等，其中量相对较少的引物称为限制引 物，相对过量的引物称为过剩引物。不对称PCR体系在反应的前几十个循环中 同时存在正向引物和反向引物，可以生成一定数量的双链产物，经过15—30个 循环左右，浓度相对较低的限制引物消耗完全。在PCR反应的后面几十个循环 中，体系中仅存在过剩引物。过剩引物在体系中扩增产生大量的单链DNA。 在高分辨熔解曲线的基本分析原理和不对称PCR扩增技术的基础上，引入 非标记探针技术，是对高分辨熔解曲线技术的一种延伸和应用。非标记探针是 长度在20-40bp左右的3’端封闭阻止延伸的一段寡核苷酸链。与传统的荧光探 针相比，非标记探针寡核苷酸链只需要在探针的3’端进行封闭阻止其在PCR 过程中发生自身扩增，而无需任何荧光基团修饰。在PCR反应完成后，进行一 个变性，复性的基本过程，探针结合到单链产物上，形成局部双链结构。再进