MiR-150对内皮祖细胞促深静脉血栓溶解再通作用研究.pdf

  MiR-150 对内皮祖细胞促深静脉血栓溶解再通作用的研究 中文摘要 MiR-150 对内皮祖细胞促深静脉血栓溶解再通 作用的研究  中文摘要  深静脉血栓形成(Deep venous thrombosis DVT)是常见的外周血管疾病，可导致 肢体肿胀、下肢缺血、血栓后综合症，甚至致死性肺栓塞的发生。现在对于 DVT 的治疗主要是各种抗凝溶栓药物的使用，但效果并不令人满意，同时抗凝药物的副 作用可导致机体凝血功能下降、消化道出血、手术患者切口并发症发生。 研究人员发现骨髓来源的内皮祖细胞 (Bone marrow-derived endothelial progenitor cells BMEPCs)可以分化为血管内皮细胞，分泌各种促血管生成因子从而 促进缺血组织的血管新生。研究证实，EPCs 可以归巢到深静脉血栓中促进血栓机 化再通。我们实验组前期的研究也发现移植 EPCs 后可以改善血栓内的微环境，促 进急性静脉血栓溶解及慢性血栓再通。但是由于 EPCs 增殖能力及迁移归巢能力较 弱，EPCs 的应用受到很大的限制。如何更好的改善 EPCs 的功能成为广大学者的 研究方向。 MicroRNAs(miRNAs)是一类小分子非编码RNAs ，可在转录后水平调控基因表 达。研究证明MicroRNAs在血管新生过程中扮演了重要角色。miR-150最初被发现 于免疫相关细胞中，控制着淋巴细胞的生长分化。研究发现，miR-150可促进间充 质干细胞迁移。单核细胞分泌的miR-150可以提高人微血管内皮细胞迁移及成血管 能力。但是，miR-150对于EPCs 的功能影响，特别在深静脉血栓再通中的作用却未 见相关报道。 本实验研究中，我们采用密度梯度离心法分离SD大鼠的骨髓单个核细胞（Bone marrow-derived mononuclear cells, BMMNCs ），EGM-2MV培养基诱导、培养、扩 增骨髓源性EPCs并鉴定。体外实验中，我们将对照寡核苷酸和miR-150 的模拟物或 抑制物采用电转的方法，转染EPCs ，探讨miR-150对EPCs 的功能影响。为了进一步 研究miR-150对EPCs在深静脉血栓机化再通中的作用，我们构建了携带miR-150 的 I   中文摘要 MiR-150 对内皮祖细胞促深静脉血栓溶解再通作用的研究  慢病毒表达载体并转染到大鼠EPCs 中，将转染后的EPCs注入到大鼠深静脉血栓模 型中。研究结果发现，过表达miR-150能够促进大鼠EPCs 的迁移成管能力，促进EPCs 归巢到静脉血栓中，加速血栓的机化再通。我们的研究揭示了miR-150对EPCs功能 的影响，可能为深静脉血栓治疗带来新的希望。 本实验研究，将分为4个部分。主要研究方法及结果如下。 第一部分 大鼠骨髓源性内皮祖细胞的分离、培养及鉴定 目的：分离、培养并鉴定大鼠骨髓源性内皮祖细胞(endothelial progenitor cells， EPCs) 。 方法：采用密度梯度离心方法分离大鼠骨髓单个核细胞，采用内皮培养体系 EGM-2培养剂进行诱导分化定向诱导培养14-21天，观察细胞的生长形态变化，结 合免疫组化、免疫荧光、流式细胞仪技术检测内皮细胞表面标记及造血干细胞表面 标记，采用Matrigel成管实验及DiI-ac-LDL摄取实验检测内皮细胞的功能学特性。 结果：新分离的骨髓单个核细胞（BMMNCs ）呈圆形，48 h后部分细胞开始贴 壁，贴壁细胞呈纺锤型形态，细胞集落形成，细胞培养至第10～12天逐渐融合，细 胞形态呈现出鹅卵石样改变。DiI-acLDL摄取结果显示，细胞能够吸收DiI-ac-LDL 。 Matrigel成管实验显示培养的细胞能形成管状、网络状结构。流式细胞仪分析及免 疫荧光检测结果显示，细胞主要表达内皮特异性标记物VEGFR 、vWF ；几乎不表 达造血干细胞表面标记CD133 。 结论：本实验成功地建立了一套大鼠骨髓血管内皮祖细胞分离、培养、诱导分 化及鉴定的方法体系。在特定