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负性共刺激分子B7-H4 表达模式及功能研究 中文摘要 负性共刺激分子B7-H4 表达模式及功能研究 中文摘要 B7-H4 是2003 年由多位科学家发现的B7 家族的一个成员，属协同刺激分子的 一类，在限制、终止和削弱T 细胞的免疫应答中提供了重要的负性共刺激信号。在淋 巴组织和非淋巴组织中能检测到B7-H4 mRNA 的广泛表达，但其蛋白却在这些正常 组织中检测不到。相反，经研究发现在人类许多恶性肿瘤如卵巢癌、肾癌及胃癌中该 分子却呈高表达，研究表明 B7-H4 在帮助肿瘤细胞逃逸免疫应答过程中起到了非常 重要的作用。由于研究者一开始就发现B7-H4 分子含有信号肽，并可与活化T 细胞 表面受体结合抑制T 细胞增殖，因此B7-H4 分子一开始就被定位为膜蛋白。但是之 后有研究发现在许多肿瘤细胞内 B7-H4 不表达于细胞膜而表达于细胞内。而我们在 研究中发现人 B7-H4 含有核定位序列，推测该分子可能是一双定位蛋白。为研究核 定位序列对B7-H4 功能的影响，本文构建了B7-H4 野生型与核定位序列突变体转基 因细胞进行研究，本研究为负型共刺激分子功能的研究提供了新思路。 本论文主要包括以下三部分内容： 一、B7-H4 在肿瘤细胞中的亚定位 在SK-BR-3，MDA-MB-453 ，MCF-7，U937 和 THP-1 细胞株中加入核输出抑制 剂LMB，使B7-H4 分子在细胞核中堆积，通过激光共聚焦显微镜观察B7-H4 分子在 细胞中的亚定位。实验结果发现在 LMB 的作用下 B7-H4 可聚集在细胞核，说明人 B7-H4 分子可转移到细胞核，这一结果说明 B7-H4 分子不仅仅是一单纯的膜蛋白， 还可以转移到细胞核。 二、人B7-H4 野生型基因的克隆及突变体基因的构建 我们用软件分析人B7-H4 的基因序列，发现其中有一段核定位信号序列（NLS ） -KRRSH ，而鼠源性的B7-H4 则无。且在鼠源性B7-H4 中与KRRSH 所对应的序列为 KRRSQ 。我们通过RT-PCR 法克隆出野生型B7-H4 基因，然后应用定点突变法获得 无NLS 的B7-H4 突变体基因，经测序确认后再将野生型及突变体基因分别与真核质 粒pIRES2-EGFP 连接，并经双酶切与测序确认。 I 中文摘要 负性共刺激分子B7-H4 表达模式及功能研究 三、人 B7-H4 野生型基因及突变体基因转染细胞的构建及细胞毒分析和促细胞 增殖的研究 将上述实验获得的野生型 B7-H4 基因（B7-H4-WT ）、突变体 B7-H4 基因 （B7-H4-MT ）和真核质粒pIRES2-EGFP 基因用脂质体共转法分别转染进入肾细胞癌 786-O 中，然后进行细胞毒分析。发现在抗肿瘤药物（五氟尿嘧啶、长春新碱、阿霉 素）的作用下三组转基因细胞株中B7-H4-WT 细胞组的抵抗细胞毒性的能力最强，其 次为突变组，Mock 组的最弱。然后研究这些细胞株的增殖率。在实验过程中我们分 别测定0h、24h、48h、72h 和96h 的细胞数目来研究其增殖率，发现B7-H4-WT 转基 因细胞组的增殖率最高，其次为突变体组与MOCK 组，两者相差不多。以上结果说 明B7-H4 促进细胞增殖及赋予细胞抗凋亡作用与其核转移功能密切相关。 本研究首先分析了 B7-H4 分子在肿瘤细胞中的亚定位，从实验结果推断其能在 细胞核和细胞质间转移，并存在一核定位序列。我们分析其序列确认了NLS 的存在。 然后通过构建 B7-H4 野生型、突变体及阴性对照组的转基因细胞来进行初步的体外 研究，验证 B7-H4 可转移到细胞核并促进肿瘤细胞的增殖，本项研究为以后的负性 共刺激分子的功能研究开创了新的研究思路，为肾癌的临床治疗提供理论依据与实践 探索。 关键字：B7-H4 ； NLS ；肾癌；细胞毒；增殖率 作 者：李金美