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毕赤酵母糖基工程改造及WFDC2生物学活性的探讨
目 录
摘要………………………………………………………………………………………．……………………．i
Abstract…．…．……．…．……．…．……．…．……………．…．……．…．……．…．．………．……．…………．…．…iii
缩略词表………………………………………………………………………………vi
前言…………………………………………………………………………………………………………………1
1毕赤酵母表达系统………………………………………………………………．．1
1．1毕赤酵母表达系统的优点……………………………………………………．1
1．2酵母的N．糖基化途径…………………………………………………………2
1．3毕赤酵母N．糖基化改造的研究进展…………………………………………5
2糖基化对蛋白药物的影响…………………………………………………………7
3乳清酸4．二硫化蛋白(WFDC2)………………………………………………～8
4本课题的研究目的………………………………………………………………11
第一章毕赤酵母糖基工程改造………………………………………………………12
一毕赤酵母糖基工程改造刈CHl基因的敲除…………………………………12
前言……………………………………………………………………………………………………．．12
1材料…………………………………………………………………………………………………………12
1．1菌种与质粒…………………………………………………………………一12
1．2工具酶、抗体………………………………………………………………．．12
1．3主要试剂及试剂盒…………………………………………………………一13
3
1．4主要仪器……………………………………………………………………一1
1．5培养基………………………………………………………………………．15
1．6主要溶液……………………………………………………………………．．16
2试验方法：………………………………………………………………………17
2．1pZBMFC2正反向筛选载体的构建和鉴定…………………………………一17
2．2毕赤酵母KM71
2．3敲除毕赤酵母KM71的OCHl基因………………………………………．．28
2．4OCHl基因敲除菌株的表型鉴定……………………………………………．29
万方数据
华中农业大学2014届博士研究生学位(毕业)论文
2．7
2．8
WFDC2蛋白的纯化…………………………………………………………35
2．9
WFDC2蛋白的糖链分析……………………………………………………37
3结果与分析………………………………………………………………………40
3．1pZBMFC2正反向筛选载体的构建…………………………………………．40
3．2
mazF基因对毕赤酵母毒性的验证…………………………………………．．41
3．3毕赤酵母KM71
3．5敲除毕赤酵母刚71的OCHl基因…………………………………………43
3．6OCHl基因敲除菌株的表型鉴定……………………………………………45
3．8WFDC2表达菌株的鉴定……………………………………………………48
3．9RNase
B的N-糖基化分析方法的建立………………………………………52
3．10
K_岍DC2蛋白的糖链分析………………………………………………一55
3．11Kochl．WFDC2的糖链分析…………………………………………………57
4讨论………………………………………………………………………………………………………．．58
二毕赤酵母糖基工程改造——-N．糖酰胺酶F(PNGaseF)的重组表达
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