产淀粉酶的活性芽胞杆菌的分离、鉴定和育种.docVIP

题目 产淀粉酶的活性芽胞杆菌的分离、鉴定与育种 摘要 首先通过淀粉培养基从土壤中筛选出产淀粉酶的活性菌株，对菌株初步鉴定后进行微波诱变，筛选出产量高、性状优良的正突变菌株，并用正交实验的方法，从发酵培养基三个主要成分（玉米粉、黄豆饼粉、酵母粉）对产酶条件进行优化，实验最后利用多相分类的方法对筛选出的正突变菌株做了菌种鉴定，初步确定为短芽孢杆菌。 引言 淀粉酶是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一。淀粉酶种类繁多,特点各异,在造纸、印染、酿造、果汁和食品加工、医药、洗涤剂、工业副产品及废料的处理、青贮饲料及微生态制剂等多种领域具有广阔的用途[1]。现在淀粉酶主要来源于植物和微生物[2]并通过发酵完成生产，因此筛选出高产、稳定的淀粉酶产生菌是淀粉酶生产的头等大事[3]。本文试图从土壤中分离出产淀粉酶的芽孢杆菌，通过诱变育种及发酵条件优化来得到高产、稳定的淀粉酶产生菌株。 研究方法 1、实验材料：河北大学生命科学学院院前的土壤 2、仪器设备：高压蒸汽灭菌锅、培养皿、培养基分装器、PH试纸、移液管、吸耳球、玻璃棒、量筒、三角刮、试管、试管架、酒精灯、电子天平、显微镜、三角烧瓶、洗瓶、接种针、接种环、双层瓶、擦镜纸、德汉氏小管、直尺、记号笔等。 诱变箱：微波炉（E30E-3） 离心机、721分光光度计： 3、培养基和试剂 （1）培养基：淀粉培养基、牛肉膏蛋白胨培养基、种子培养基[4、7]、出发培养基[4、7]、糖发酵培养基、明胶培养基、柠檬酸盐培养基、醋酸铅培养基、蛋白胨液体培养基（吲哚实验）、葡萄糖蛋白胨培养基（V.P.、M．R实验）、硝酸盐液体培养基、酪素培养基 （2）试剂：碘液、孔雀绿染液、番红染液、乙醚、吲哚试剂、KOH、α-耐酚、甲基红、格里斯氏试剂、锌粉、3%H2O2 、柠檬酸缓冲液、1%淀粉溶液、3,5-二硝基水杨酸（注：所用药品均为分析纯）。 4、实验方法 （1）细菌的分离与初步鉴定： 将土壤系列稀释，把10-4、10-5、10-6分别涂布到淀粉培养基上，37℃倒置、过夜培养，影印，将碘液加到淀粉平板上，记录出现水解圈的单菌落的H/C值[5]。将出现水解圈的菌落进行芽孢染色，显微观察菌种形态。保菌供下次实验用。 （2）微波诱变[6]： 将新鲜斜面上的菌种转接到液体的牛肉膏蛋白胨培养基中37℃下培养18-24h。将菌液离心、洗涤、稀释，在一定功率下分别诱变30s、60s、90s，稀释菌液并涂布到淀粉培养基平板上，37℃下过夜培养，分别测水解圈的H/C值，将正突变的菌种保存到斜面培养基上。 （3） 高产菌株发酵条件的优化[7]： 通过正交试验对高产菌的发酵条件进行优化，建立高产菌株的最佳摇瓶发酵条件。 将诱变得到的菌种接种到种子培养基瓶中培养12-16h，之后，将种子瓶中的菌液以5%的接种量分别接种到出发培养基和优化培养基中，发酵18-24h后，用DNS法测酶活及制麦芽糖-OD标准曲线，确定最佳发酵条件。 水平 实验因素 玉米粉 A（g/L） 黄豆饼粉 B（g/L） 酵母粉 C（g/L） 1 8 18 2 2 9 22 4 3 11 23 5 试验号 因素 A B C D 1 1 1 1 1 2 1 2 2 2 3 1 3 3 3 4 2 1 2 3 5 2 2 3 1 6 2 3 1 2 7 3 1 3 2 8 3 2 1 3 9 3 3 2 1 (4)活性菌株的鉴定[8]： 利用多相分类的方法对所分离的菌株进行鉴定： 形态鉴定：个体和群体形态鉴定 生理生化反应：将诱变得到的正突变菌株进行以下反应：糖发酵实验、甲基红实验、V.P实验、柠檬酸盐利用实验、吲哚实验、H2S实验、硝酸盐还原实验、明胶水解实验、过氧化氢酶实验、酪素水解实验、耐盐实验。（注：各实验所用培养基及试剂见附录） 研究结果和分析 显微镜观察芽孢染色，可知分离得到的为芽孢杆菌。 H/C值 （1）在分离芽孢杆菌时，影印之后水解圈粘连在一起，无法准确测得H/C值。 分析：可能是所采土样中产淀粉酶的芽孢杆菌含量较多，涂平板之前稀释倍数不够导致单菌落过于密集，水解圈粘连。 （2）紫外诱变后的平板影印： 单菌落 透明圈直径/mm(H) 菌落直径/mm(C) H/C ① 4.8 3.0 1.6 ② 6.4 3.5 1.8 ③ 15.8 4.8 3.3 ④ 16.0 4.9 3.3 ⑤ 11.8 4.5 2.6 ⑥ 9.8 4.0 2.5 ⑦ 17.0 5.0 3.4 分析：通过结果，可看出经过紫外诱变后，有的菌株产酶活能力有所提高，有的减小，筛选产酶活能力最高的菌株，保存供后续试验使用。 3、正交试验优化发酵条件 （1）、麦芽糖标准曲线 分析：标准曲线的精确度不