一株北高丛蓝莓内生真菌的液体发酵条件优化及生长动力学分析.docVIP

一株北高丛蓝莓内生真菌的液体发酵条件优化及生长动力学分析 ? ????植物内生菌能产生促进植物生长物质，如植物生长素、赤霉素、细胞激动素等，能直接促进植物生长。从兰科药用植物中分离的5种内生真菌能产生赤霉素、吲哚乙酸、脱落酸、玉米素、玉米核苷等植物激素，对兰花的生长发育有较好的促进作用。研究表明，内生菌可通过自身的代谢产物或借助于信号传导作用对植物体施加影响。植物内生真菌的液体培养具有生产周期短、产量高、质量易于控制等优势，有利于规模化生产。目前对北高丛蓝莓内生真菌的液体培养及代谢产物研究较少，笔者选择一种适合工业发酵的培养基，并通过液体培养条件的优化及生长动力学分析，以期为大规模工业化生产提供技术依据。 1材料与方法 1.1??材料 1.1.1??供试菌株。由辽宁省农业科学院微生物工程中心实验室从北高丛蓝莓根内分离，编号为LM003。 1.1.2??主要仪器。pH电极和溶氧电极，均购自梅特勒一托利多仪器有限公司；发酵罐，购自上海保兴生物设备工程有限公司；摇床，购自哈尔滨东联电子技术开发有限公司；培养箱，购自施都凯仪器设备止海）有限公司。 1.1.3??主要试剂。所用试剂均为国产分析纯，市售。 1.2方法 1.2.1??培养基的制备。①斜面及平板培养基。马铃薯200 g，葡萄糖20 9，琼脂18 9，蒸馏水1 000 ml，121 cC灭菌25 min。②种子培养基。马铃薯200 9，葡萄糖20 9，麦芽粉5 9，维生素B1 0.5 mg，蒸馏水1 000 ml，121 cC灭菌25 min。③发酵培养基。玉米粉90 9，豆粕5 9，KH2P04 1.0 9，MgS04 0.6 g，维生素B1 10 mg，蒸馏水1 000 ml，121℃灭菌25 min。 1.2.2??菌种活化。将编号LM003的菌种从试管斜面上接到平板培养基上，恒温25 cC培养7d。 1.2.3??一级种子培养。将活化好的真菌用打子L器琼脂挖块接种于装有200 ml种子培养基的三角瓶，于25℃，160 r/min摇床上振荡培养3 t1作为种子。 1.2.4??液体发酵有关参数的考察。通过4因素3水平正交设计试验??考察培养温度、培养基pH、摇床转速、接种量等条件对菌丝体生长的影响，筛选最佳发酵条件。 1.2.5??液体深层发酵的生长动力学考察。将确定的发酵培养基装于10 L发酵罐中，装量为6L，121℃灭菌20 min，冷却后接种一级种子，接种量为5%，温度25℃，初始pH 7.0，搅拌转速160 r/min，培养7d，每天取样。将收获的发酵液过滤，菌丝体用蒸馏水洗涤，80℃烘干3h后测干重，发酵液直接用于pH和残糖的测定，制得生长代谢曲线。 2结果与分析 2.1一级种子液培养情况??摇床培养前2 cl，接入的菌丝块呈球状不断增大，发酵液较澄清，第3-5天出现大量微小菌丝球，并不断增长，发酵液较粘稠，培养至第5天接入摇瓶进行培养参数的考察。 2.2液体培养有关参数的确定??液体培养中，培养基初始体积的不同，对菌丝体干湿重之比影响较大，因此实验中采用菌丝体干重来衡量菌丝体生长情况，以g／L记。以下试验以液体发酵培养基进行发酵培养。 ????对菌丝体生长的影响因素由大到小的顺序是培养基pH值培养温度摇床转速接种量。菌体最适培养条件为A2 82C。D．该培养条件下，菌丝体干重为20.5 g/L。对试验结果进行方差分析可知，pH值对液体菌种的培养有显著影响p 0.05）。pH值除了对菌体本身的影响外，还影响培养基中的有机化合物的离子化和营养物质的溶解度，从而影响菌体对基质的利用速度。 2.3生长动力学考察结果 2.3.1??生长量变化曲线。图1表明，菌丝体在O-ld生长缓慢，为生长适应期，第2天起可见絮状菌丝逐渐增多。在第2-3天为对数生长期，菌丝体急剧增加，菌丝相互缠绕形成菌丝球。第4-5天为稳定生长期，体内次生代谢产物积累较多，第6-7天菌丝体生物量减少，发酵液变粘稠，开始自溶。因此确定菌丝体较适合的收获时间为第4-5天。 2.3.2??糖代谢曲线。菌丝体的生长过程在第1~3天对糖的利用比较迅速，最初糖浓度为19.0 g/L，培养7d时剩余的还原糖浓度为9.7g／L，生长过程中平均消耗速率为1.3g／L．d，在对数生长期内还原糖吸收利用较快，浓度从17.1 9／L降到12.4 9／L，均消耗速率为2.35 9／L．d，第4-6天对糖的利用趋于缓慢。糖代谢曲线的趋势与菌丝体生长量的变化的趋势基本相符。 2.3.3??pH值变化曲线。图3表明，菌丝体的液体培养过程中，pH值在7.0 -5.15范围内波动，基本保持稳定。培养的第2-3天pH下降较快，第4-7天变化较小，第7天pH小幅上升，可能与菌丝体自溶有关。培养结束时发酵液pH值为5.19。 2.3.4??溶氧