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核酸提取、测定及电泳分离 一、实验目的 掌握DNA和RNA分子结构与功能相关知识。 掌握DNA和RNA分离纯化的原理和方法。 熟悉离心机的使用。 二、实验原理 三、实验材料 三、实验材料 实验器材 离心机; 研钵，研槌； 不锈钢剪刀； 试管、试管夹； 吸管； 比色杯，离心管。 玻棒、烧杯； 恒温水浴箱 四、实验步骤 提取步骤： （1）将新鲜肝脏剪碎放入预冷的研钵中，研磨3分钟后加入10ml 1mol/L（0.14mol/L用于RNA提取）NaCl溶液，继续研磨1-2分钟。 （2）将匀浆液4ml转入离心管中，拧紧管盖，配平后置于离心机3000转离心10分钟。 （3）小心取出离心管，移取上清液至新的离心管中，加入等体积氯仿-异戊醇，上下颠倒震荡1-2分钟，配平后置于离心机3000转离心10分钟。 （4）小心取出离心管，吸取上清液（留取1-2ml上清液待测定核酸含量）至玻璃试管中，加2倍体积95% 冰乙醇，轻轻晃动试管，观察丝状DNA沉淀和点片状RNA沉淀析出。 五、注意事项 在提取核酸时，为了保持核酸的完整性，防止核酸变性降解，操作时必须防止过酸或过碱。全部过程应在低温下(0℃左右)进行，必要时还需加入抑制剂，以抑制核酸酶的作用。 加氯仿、异戊醇后振摇要充分，但又不能太剧烈，以防DNA断裂。 要学会正确使用离心机，离心后，注意上清液和沉淀的取舍。 核酸含量测定 实验目的： 了解DNA和RNA测定的原理 熟悉分光光度计的使用。 掌握二苯胺法测定DNA含量及地衣酚法测定RNA含量的方法。 实验步骤： 取三只试管，编号，加入如下图所示的试剂： 取三只试管，编号，加入如下图所示的试剂： * * 如果A260/280过高，则二苯胺法测量的稀释倍数应相应减小 西安医学院生化教研室 核酸提取 根据核糖核蛋白（RNP）与脱氧核糖核蛋白（DNA）在一定浓度的氯化钠溶液中的溶解度不同进行分离，然后用蛋白质变性沉淀剂去除蛋白，使核酸释放出来，再利用核酸不溶于乙醇的性质将核酸析出，达到分离提纯的目的。 试剂 0.14mol/L氯化钠溶液 （内含0.01mol/L柠檬酸），250ml； 1mol/L氯化钠溶液，250ml； 95%乙醇（冷）； 氯仿-异戊醇（V/V=24：1） 实验原理： 加热条件下： RNA＋浓盐酸＋地衣酚 绿色（670nm处有最大吸收） DNA＋酸＋二苯胺 　蓝色（595nm处有最大吸收） 试剂 地衣酚（orcinol）试剂：称取100mg地衣酚溶于100ml 浓盐酸中，再加入100mgFeCl3·6H2O 二苯胺试剂：称取1g二苯胺（经重结晶）溶入100ml冰醋酸中，再加入2.75ml浓H2SO4摇匀。 RNA标准液（200μg/ml) DNA标准液（400μg/ml) - 1.0 - DNA样品溶液 混匀后，置沸水浴中水浴10分钟，冷却测 OD595 2.0 2.0 2.0 二苯胺试剂 1.0 - - H2O - - 1.0 DNA标准溶液 空白管 样品管 标准管 管 号 试 剂（ml） 注：二苯胺法的测定范围是40-400 ug/ml DNA，浓度太小会影响测定结果 计算： C测（μg/ml）=（OD测/OD标）XC标 - 1.0 - RNA样品溶液 混匀后，置沸水浴中水浴10分钟，冷却测 OD670 3.0 3.0 3.0 地衣酚试剂 1.0 - - H2O - - 1.0 RNA标准溶液 空白管 样品管 标准管 管 号 试 剂（ml） C测（μg/ml）=（OD测/OD标）XC标 一 实验目的 学习琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法 掌握琼脂糖凝胶的配制方法 熟悉电泳仪的使用方法 决定DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素： DNA分子的大小 双链DNA分子在凝胶基质中迁移的速率与其碱基对数的常用对数成反比。分子越大，迁移得越慢，因为摩擦阻力越大，也因为大分子通过凝胶孔径的效率低于较小的分子。 琼脂糖浓度 给定大小的线状DNA片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中迁移速率不同。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度之间存在线状相关。 二 实验原理 分离不同大小DNA片段应使用的琼脂糖凝胶浓度