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欢迎各位同行一起学习交流和分享PIERCE在分子生物学和蛋白质领域的成功经验! 一.Western Blotting的问题与对策 Western Blotting方法选择 检测系统比较 检测方法 影响Western blotting成功的要素 常见问题分析与对策 Western Blotting方法 间接法： 优点： 1.免疫特异性不受标记影响 2.信号放大,灵敏度高（多个二抗结合位点） 3.多种标记的二抗可供选择 4.可选择不同的Marker 缺点： 1.有交叉反应引起的非特异性条带 2.额外的二抗孵育以及条件优化 3. 检测方法 化学发光法: 灵敏、快速、高效、无害、特异性高 化学显色法: 方便、有毒、灵敏度较低、不易保存 同位素法 : 灵敏度高、不安全、 环境污染、不方便和半衰期短 荧光底物法 蛋白抽提/样品制备/电泳 蛋白抽提 M-PER?培养细胞总蛋白提取试剂Pro#78501, 78503, 78505 T-PER?动物组织总蛋白提取试剂Pro#：78510 B-PER?细菌总蛋白提取试剂Pro#：78243, 78248，78260，78266 Y-PER?酵母总蛋白提取试剂Pro#:78990，78991，78998 和78999 I-PER?昆虫细胞总蛋白提取试剂Pro#:89802 P-PER?植物细胞总蛋白提取试剂Pro#:89803 Mem-PER?真核膜蛋白提取Kit Pro#:89826 NE-PER?胞质 核蛋白抽提试剂Pro#78833 线粒体抽提Kit Pro#：89874 蛋白酶抑制剂 样品中是否有干扰物质 各种预制胶，转膜液，Markers 最佳抗体稀释倍数（点杂交） 2－5ul不同稀释梯度的样品于NC膜，自然干燥10－30min 室温封闭1h 加入一抗/二抗：1/20,1/100; 5/20,5/100) X000 TBS或PBS洗膜4－6次X5min(0.05% Tween-20) 加入二抗,室温孵育1h TBS或PBS洗膜4－6次X5min 底物孵育：8cm2/mL 曝光时间：30－60 Sec SuperSignal ? Western 化学发光底物 Twice the flash.? Half the Cash SuperSignal ? 化学发光底物发光的原理和特点 高灵敏度：比化学显色法高103-106倍 快 速：1 min 高特异性：高信/噪比 检测方便： X光片或CCD检测 多次曝光：选择满意的信号强度 反复检测：用不同特异性抗体，对同一蛋白上不同决定簇进行检测分析 SuperSignal? West Pico与ECLTM发光强度和灵敏度比较 SuperSignal? West Pico 5分钟发光 ECLTM系统5分钟发光 稳定性 常温下稳定保存至少1年，无须预热，直接使用 工作液常温下至少保持24小时，光或黑暗均可用 极大的减少一抗用量,是同类产品一抗用量的1/5-1/10，稀释倍数是1000－5000倍 二抗用量是同类产品二抗用量的至少1/10，稀释倍数是20000－10000倍 注意：抗体的稀释倍数是由底物和待检测蛋白质的丰度决定的，为了获得最佳实验结果，强烈推荐进行点杂交预实验，以确定具体的实验参数。 如何选择合适的Pico底物或Kit 底物（50ml，100ml，500ml，1L） 标准检测Kit：500ml底物＋2ml山羊抗鼠，兔二抗 完整检测Kit： 500ml底物＋2ml山羊抗鼠，兔二抗＋1L封闭液＋4包洗脱液 2. Pierce ECL Western Blotting Substrate 一半的价钱 无须优化任何条件 Pro#:32106(500mL);32209 (250mL) 32109 (50mL) 3. SuperSignal? Dura-化学发光底物 24小时发光时间：比任何其它改良的HRP化学发光底物提供的要长10倍； 10-14克级灵敏度 节省抗体：抗体稀释度达一抗1000-50,000和二抗50,000 -250,000倍 立即产生强烈信号，特别适合CCD仪器检测 工作液稳定24小时；常温保存一年 4. SuperSignal? Femto化学发光底物 最灵敏的化学发光底物： 10-15克 一抗稀释度：1/5000-100,000 二抗1/100.000-500.000 用于极端微量样品的检测 抗体珍稀样品的检测 稳定：4°一年，室温半年 免费Pierce高质量二抗 SuperSignal? 底物的突出优势 花费更少 强信号 8－24小时的发光时间 多种灵敏度选择：10-12-10-15 节约抗体:是其它底物用量