RT-PCR为基础T-RFLP应用于乳品发酵中新陈代谢活性细菌半定量分析.pptVIP

RT-PCR为基础的T-RFLP应用于乳品发酵中新陈代谢活性细菌的半定量分析 authors Jorge I. Sanchez , Lia Rossetti , Beatriz Martinez , Ana Rodriguez, Giorgio Giraffa journal Journal Microbiological Methods 一.前言 几种奶酪生产中常用的初始培养物通常包括成酸性的乳球菌，和一些通常属于乳酸乳球菌乳酸亚种、二丁酮链球菌和明串珠菌属某些种的利用柠檬酸盐的菌株。这些培养菌对于器官感觉的特征的发展是非常重要的。确定的菌株的初始物已经被奶酪制造商日益增多地采用，作为一种尝试来解决与未受控制的自然发酵相关的问题。这对于奶酪的质量有积极的效果。因为整个发酵过程中菌株的平衡是一个关键点，所以需要监控任何对细菌群落结构的暂时影响，这些影响可能改变想得到的奶酪的特性的正确过程。 培养作为一种评价食品中微生物群落多样性和动力学的方法已经有几十年了。以培养为基础的方法被长期接受并获得普遍成功，但是这些技术费时费力，而且在某些情况下不一定能提供微生物群落组成的可靠信息。未知的和不可培养的种的出现以及样本的混合和稀释步骤会对微生物的生存能力产生影响，能够导致对产品真实生态学组成的失真的观察。 在不利条件下，比如营养耗尽、低温和其他压力，某些微生物能进入可生存的但不可培养（VNC）的状态。VNC 状态的微生物仍然具有新陈代谢活性但是不能在通常支持它们生长的培养基上形成菌落，因此它们不能被传统的方法发现。 为了克服这些问题，免培养法比如变性梯度凝胶电泳/温度梯度凝胶电泳（DGGE/TGGE）、单链构象多态性（SSCP）、荧光原位杂交（FISH），或者以 PCR 为基础的技术比如长度异质 PCR（LH-PCR） 和末端限制性片段长度多态性（T-RFLP）在过去几年得到发展。T-RFLP 是一种分析不同细菌的16s rRNA 的差异，并提供微生物种群结构信息的方法。它是以限制性核酸内切酶消化荧光末端标记的PCR产物为基础的。单独的末端限制性酶切片段（T-RFs）被电泳分开并由荧光信号亮度量化。依靠微生物群落的物种组成，获得明显的外形（T-RF图案），一种代表一个物种的存在。一个相对定量的分布可以获得，因为每个顶点的荧光密度是和混合物中每个物种的 DNA 量成比例的。 然而，PCR 的偏差可能对微生物群落真实组成的量化产生消极的影响。以 DNA 为基础的方法的缺点是不能区分活的和死的生物体，因为溶解细胞中的 DNA能够在自然环境中存在很长时间。因此，以 DNA 为基础的 PCR 不能区分生活的、VNC 和死细胞，这就限制了它用于监控目的的使用。在死细胞中 RNA 比 DNA 降解的快，因此，逆转录酶 PCR（RT-PCR）可能是生存能力、新陈代谢活力和细胞完整性的一个好的指示器。 这项工作的目的是检验与 RT-PCR 相连系的 T-RFLP 监控确定微生物种群（比如乳品确定菌株的初始物）的新陈代谢活性部分的群体动力学的能力。在这一点上，研究了整个发酵过程中两种确定菌株的初始物的成分的演变。 二.材料与方法 2.1 细菌菌株和生长条件 本研究中使用的细菌菌株包括从人工奶酪中分离的两株柠檬明串珠菌菌株（IPLA621 和 IPLA1687）和一株乳酸乳球菌乳酸亚种菌株（IPLA947）。明串珠菌属在 MRS 肉汤和乳球菌在 M17中被常规地繁殖。 2.2 确定菌株初始物培养 两种确定菌株初始物培养物在10%（wt/vol）复配脱脂乳（RSM）中准备；培养物A包括乳酸乳球菌乳酸亚种IPLA947 和柠檬明串珠菌IPLA621，培养物B包括乳酸乳球菌乳酸亚种IPLA947 和柠檬明串珠菌IPLA1687。前一夜的肉汤培养物在乳中 1% 被转接，给与起始的种群比率，大约是3∶1.3，分别为乳球菌和明串珠菌。培养物在30℃培养，并于0，3，6，9和24小时取样。 2.3 微生物分析 10倍稀释法在四分之一浓度套环溶液被使用，在含有万古霉素（30 mg ml-1）的 MRS 琼脂和为明串珠菌准备的蔗糖（2% wt/vol）或者为乳球菌准备的加入环己米特的M17琼脂中进行选择性计数。平板在30℃培养48小时。 2.4 DNA提取 在 MRS 或者 M17 培养基上生长的纯培养物的 DNA 用如前文描述的基于chelex的程序进行提取。分离的 DNA 在使用前在-20℃温度下保存。 2.5 从如培养物中提取 RNA 用9ml EDTA（1% wt/vol, pH 12）预处理从乳培养物得到的1ml样品，使凝固的酪蛋白分散以利于细胞的分离。样品在8000×g离心5分钟，然后用TE buffer洗两次。沉淀物在含有lysozime（20 mg