树干毕赤酵母cna文库构建及est序列测定.pdfVIP

摘 要 将植物纤维水解液中30％左右的术糖有效利用转化为酒精是降低酒精生产成本的关 键。树干毕券酵母是研究得最多、最具工业应用前景的木糖发酵酵母，目前对于树干毕赤 酵母木糖代谢的生理学孝惩铡还赧之甚少。 SequenceTag，表遮窿歹|j标签)羧术是一秘 以eDNA文瘁为基舔靛EST(Expressed 快速的进行撼因功能分卡斤及发现新基因的有效方法。本论文构建了树干毕赤酵母P5776 (PichiaStipitisCBS 疼列溅定，为黪母鲍基因沩能分辑、本耱我落途径磷究蚨及舞选蠢芙瞧状基困爨供了基礁 l 工其。 { 以具有不同生长速率的树干毕赤酵母为材料提取RNA，发现处于对数中期(OD600约 为2．1)的酵母细胞易于提取出总RNA；分别以匀浆法、玻砂法、液氮研磨法以及液氮速 冻宓硅滚氯磷黪的方法酸碜缀驻，再分嬲蔽TRIZOL(苯酸弱买酸酸鬣黢蕊均一溅会镑)弱 交性裂解滚(主要成分楚§一巯基乙醇粒异硫酸氰瓢)为试剂在溶解P5776细胞缀分的同时 保持其中RNA的完整性，通过苯酚和飘仿多次抽撮除净杂蛋白，以异丙醇沉淀回收特异 的保留在水朦中的RNA，最后经乙醇洗涤得到备用RNA。结果发现，运用变憔裂解液， 采取滚氧速冻趣滚氮骚壤麴方法提取黪霹缎鼹RNA，效果夷好。零论文鞋约900mg(干 完整性，质激高，是eDNA文库构建的良好材料。 以提取出的RNA为树料，纯化出mRNA(messagerRNA，信使RNA)，经反转录酶反 转录出cDNA第一链，戳嚣换会戏法会残eDNA双链，逶过荻筑铯溺羧瓣方滚薅透窭其 中大于500bp的片段与载体连接，最詹两电转化法转化宿主菌，构建出树干毕券酵母P5，76 units，噬菌斑 的eDNA文库，经质量检测，初级文库滴度达到1．0×106pfu(plaqueforming 300bp，这蘸eDNA文疼稳建要求，竞念哥鞋弱予大筑模EST窍舞溅定及数鬃努褥。 eDNA文库铺布麓自斑筛选平板，挑取其中的自斑(即黧组子)经 将扩增好的P5776 Chain Reaction，聚会酶链式 其有该雩}黪RNA聚合酶褒动子)为雩|锈经PCR(Polymerase 反应)扩增出重组子插入片段，标记上荧光染料后强ABI 不可读辕蓥数小手5％。 今后主鼹工作设想怒进行EST数据分析，并结合cDNA文库制备树干毕赤酵母DNA 芯片，为木糖发酵酵母的缴物信息学研究提供基础。 关键调；本糖；楗予擎赤酵母；cDNA文疼；表达摩歹《瑟签’ ofeDNA and Construction library ESTs ofPichia st驷it／s sequencing FanYi．min Yu and Professors Min·—ren by Shi·-yuanHuang Supervised of Chemical (College Engineering，Nanj