第二章沉淀法精品.pptVIP

第二章 沉淀法 第一节 基本原理与沉淀类型 第二节 应用实例 第一节 基本原理与沉淀类型 一、基本原理 二、制备蛋白质 三、制备核酸 一、基本原理 根据各种物质结构不同，改变溶质的性质，致使抽提液有效成分溶解度变化。 沉淀（precipitation）：在溶液中加入沉淀剂使溶质的溶解度降低，形成固相从溶液中析出，从而达到分离的一种技术。 沉淀法也称溶解度法。其基本原理是：根据各种物质的结构差异（如蛋白质分子表面疏水基团与亲水基团之间比例的差异）来改变溶液的某些性质(如pH、极性、离子强度、金属离子等)，就能使抽提液中的有效成分的溶解度发生变化。 二、制备蛋白质 1. 盐析法 2. 有机溶剂沉淀法 3. 蛋白质沉淀法 4. 聚乙二醇沉淀法 5. 选择性沉淀法 6. 结晶沉淀法 1. 盐析法 (1) 盐分级沉淀 (2) 盐析曲线制作 (3) 盐析的影响因子 (4) 脱盐 a.溶解度大，对温度不敏感.(水的温度=25℃，硫酸铵的饱和溶解度=769g,当水的温度=0℃时，其饱和溶解度高=679g,这是其他盐类所不具备的。) b.分级效果好.有些抽提液经过加适量硫酸铵的一步分级沉淀处理后，就可除去杂蛋白75％以上； c.有稳定蛋白质结构的作用.将2-3 mol／L硫酸铵盐析的蛋白质置低温下保存一年，其性质没有变化； d.价格低廉，废液可以肥田。 但是用硫酸铵或其他盐类进行分级沉淀都有一个共同的缺点，即得到的样品欲继续纯化时，需花一定时间脱盐。 。 ②硫酸铵盐析 A.固体法：逐步加入固体硫酸铵，当加到一定 的饱和度时，蛋白质便可沉淀出来。 B.饱和溶液法：逐步加入预先调好pH值的饱和硫酸铵， 蛋白质便可沉淀出来。 C.透析法：透析袋放入一定浓度的大体积溶液中，通过 透析作用来改变蛋白质溶液中的盐浓度，沉淀蛋白质 。 A.固体法 盐析后要在冰浴中放置一段时间，待沉淀完全后再离心与过滤。在低浓度硫酸铵中盐析可采用离心分离，高浓度硫酸铵常用过滤方法。各种饱和度下需加固体硫酸铵的量。 （1）计算法 X=G（p2-p1）/1-Ap2 G为经验常数，0℃ 515，20 ℃ 513 A为常数 0 ℃ 0.27 20 ℃ 0.29 P2、P1为初始和最终溶液的饱和度 X为1L溶液所需加入的硫酸铵的克数 （2）查表法 调整硫酸铵溶液饱和度计算表 B.饱和溶液法 这是一种使蛋白质脱水沉淀比较温和的力法。其操作是在蛋白质溶液中逐步加人预先调好pH的饱和硫酸铵溶液，不同饱和硫酸铵溶液，不同饱和度所需的硫酸铵的量可用下列公式表示： 此法比加入固体硫酸铵沉淀法温和，但是对于大体积样品不适用。因为硫酸铵溶液的大量加入，将导致样品溶液体积增加。例如，当样品达到50％硫酸铵饱和度时，其体积增加一倍。 C.透析法：透析袋放入一定浓度的大体积溶液中，通过透析作用来改变蛋白质溶液中的盐浓度，沉淀蛋白质。 此法仅在要求较精确、样品体积小的试验使用。 如果要分离一种新的蛋白质和酶，则应先确定沉淀该物质的硫酸铵饱和度。具体操作方法如下： 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 ①盐的种类：影响KS，KS越大，效果越好 ② 溶质的起始浓度 ③ 盐析剂用量 ④温度和pH：影响β值而影响S。尤其是影响相对溶解度 ⑤杂质 透析法注意事项 ①透析带处理：用蒸馏水洗净，检查无漏洞 ②透析液选择：一般为低离子强度中性缓冲液 ③掌握透析时间：搅拌，样品液与透析液体积 比为1：10，3h. ①降低水溶液的介电常数。向溶液中加入有机溶剂能降低溶液的介电常数，减小溶剂的极性，从而削弱了溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，导致蛋白质溶解度降低而沉淀。 ②由于使用的有机溶剂与水互溶，它们在溶