氨基酸同位素标技术在肝癌疾病蛋白质组学研究中的应用.pdf

摘要 氨基酸同位素标记技术在肝癌疾病蛋白质组学研究中的应用 摘要 肝癌是世界上发生最广的癌症之一，在我国也是一种常发生的恶性肿瘤。肝癌早 期症状隐匿，不容易察觉，绝大部分患者一旦确诊往往已属于晚期，或者在手术后较 短时间内转移到其他器官，导致死亡。探讨肝癌相关分子及分子机制，寻找肝癌的生物 标记物和治疗的靶分子，对于恶性肿瘤的诊断和治疗具有重要的理论指导和临床应用 意义。利用定量蛋白质组技术从全基因组水平来研究生物学现象，比较肝癌细胞系和 肝细胞系以及比较具有不同转移潜能的肝癌细胞系的蛋白质组差异，将有助于对肝癌 机理的理解，最终指导肝癌诊断和治疗。 本论文以氨基酸同位素标记技术(从CT／SILAC)为技术平台，首先发展了一种 判断标记肽假阳性的方法，剔除假阳性标记肽对定量的影响，改进了氨基酸同位素标 记技术。最后选择了具有相同遗传学背景的两对细胞系，研究了肝癌及转移过程中蛋 白质组的差异，获得一批潜在的肝癌分子标志物。此外本论文初步研究了不同搜索软 件对定量结果的影响，为定量蛋白质组研究选择搜索软件提供依据(见附录)。 本论文的第一部分综述了定量蛋白质组研究的发展情况，首先对质谱仪器做了介 绍，然后介绍了各种定量方法，比较了各个方法的优缺点。 本论文的第二部分改进了氨基酸同位素标记技术，并研究了同肝癌及转移有关的 差异蛋白质组，具体包括： (一)标记肽假阳性的判断 本部分发展了一种判断氨基酸同位素标记方法中标记肽假阳性的方法，计算出不 同标记效率下的理论同位素分布，利用最小二乘法拟合得到标记肽的标记效率，根据 假阳性阈值来判断标记肽的假阳性。本方法经实际应用，证明简单易行可靠。 (二)高转移肝癌细胞系的表达谱 蛋白质表达谱是了解肝癌的分子基础，在本实验中，利用SDS．PAGE分离结合 分析了MHCC97H的蛋白质表达谱特点。本部分研究首先分析了表达谱的分子量和 pI等，显示了本方法在鉴定具有极端分子量和pI的蛋白质方面具有的优势，发现蛋 蛋白做了GO注释，并利用InterPro数据库分析了表达谱的蛋白质家族特性。根据 摘要 通路和蛋白质相互作用。 (三)肝癌差异谱的研究 鉴定到一批和肝癌有关的蛋白质分子，这些蛋白质分子在细胞凋亡、增殖和细胞移动 中发挥着重要的作用，借助Western blotting和免疫组化验证了定量结果的准确性和在 互作用分析了差异蛋白的生物学功能，发现多个差异蛋白参与糖酵解和三羧酸循环等 能量代谢，差异蛋白在MAPK、钙离子通路、Wnt等信号通路中也发挥作用。此外讨 论了热激蛋白、过氧化物还原蛋白、膜联蛋白、角蛋白等在肝癌中的生物学功能。 (四)肝癌转移差异谱的研究 本部分试验利用AACT／SILAC技术比较了具有高转移能力的肝癌细胞系 blotting技术，在5个具有不同转移能力的肝癌细胞系中，检验了差异蛋白和肝癌转 移能力的关系，同时也比较了差异蛋白在肝癌临床样本和癌旁组织的表达差异。利用 在细胞增殖和凋亡、细胞移动及血管生成等方面讨论了差异蛋白的生物学功能，揭示 他们在肝癌转移过程的作用。 本论文改进了氨基酸同位素标记技术，利用AACT／SILAC技术全面系统的分析了 肝癌及转移过程中的蛋白质组变化，在蛋白质水平研究了肝癌中发生的一系列分子事 件，探讨了肝癌的分子机制，研究和发掘一批与肝癌密切相关的蛋白质分子，必将有 利于深入、系统的理解肝癌机制，促进肝癌生物标志物的发掘和临床诊断应用。 关键词：氨基酸同位素标记，定量蛋白质组，肝癌，转移，生物信息学， 假阳性 BasicResearchPriorities 1CB51 ·本项研究得到National Program(2000202)； and I 1Al NationalScience TechnologyKey (2002BAC1， Pro