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第4章DNA的复制精品.ppt
溶液杂交(Solution Hbridization) 是指用变性的待测核酸溶液与放射性标记的已知单链(探针)在溶液中保温,使之形成杂交复合物。反应结束后,用羟磷灰石法或酶解法将未被杂交的单链和杂交双链分开,然后测定在杂交分子中的探针量,就可推算出被测的核酸量。 如核酸酶S1保护分析方法;RNA酶保护分析方法。 DNA的复制 放射自显影技术表明染色体复制子为双向复制 Pulse with radiolabeled nucleotide; chase with coldnucleotide. Then do autoradiography 链的终止(Termination) DNA的半不连续复制 (Semidiscontinuous Replication)由于DNA双螺旋的两条链是反向平行的,因此在复制叉附近解开的DNA链一条是5’→3’方向,另一条是3’→5’方向,两个模板极性不同。而所有已知DNA聚合酶的合成方向都是5’→3’,两条链无法同时进行复制。为了解释DNA的等速复制现象,日本学者冈崎(Okazaki)等提出了DNA的半不连续复制模型。 半不连续复制: 冈崎片段 Okazaki fragment 1、用3H脱氧胸苷短时间标记后提取DNA,得到不少平均长度为2-3kb DNA片段。 2、用DNA连接酶温度敏感突变株进行实验,在连接酶不起作用的温度下,有大量小片段累积,说明复制过程中至少有一条链首先合成较短的片段,然后再生成大分子DNA。 3、前导链的连续复制和滞后链的不连续复制在生物界是有普遍性的,因而称之为DNA的半不连续复制。 本章思考题: 1.半保留复制、复制子、冈崎片段、复制叉、单链结合蛋白、Klenow片段。 2.DNA复制一般采取哪些方式? 3.真核细胞DNA的复制有哪三个水平的调控? 4.简述端粒的复制过程? 5.DNA聚合酶5‘-3’的活性有哪些作用。 * 酶Ⅲ全酶由10种亚基组成: α、β、γ、δ、δ′、ε、θ、τ、χ、ψ,含锌原子。 α亚基 5’→3’聚合活性 ε亚基 3’→5’外切酶校对活性 提高复制保真性 由α、ε、θ组成核心酶 θ亚基 组建酶复合体 τ亚基 促进酶Ⅲ核心酶的二聚化 β亚基 夹子作用,两个β亚基夹住DNA向前滑动,使聚合酶在完成复制前始终不脱离模板,提高持续合成能力。 γ亚基复合物又称夹子装置器 帮助β亚基夹住模板 γ亚基复合物组分【γ2 δδ’χψ】 是依赖DNA的ATP酶 酶Ⅲ的复杂亚基结构使其具有高忠实性、协同性和持续性。 无校对功能时,酶Ⅲ nt 掺入错误率7×10-6,有核对功能后降至5×10-9。 各亚基功能相互协调,使全酶持续完成整个染色体的复制。 * 酶I,Ⅱ和Ⅲ在聚合性能上都是多亚基酶,酶Ⅱ和Ⅲ共用多个辅助亚基, 在速度、持续合成能力方面有很大不同,酶Ⅱ是修复酶,酶Ⅲ是复制酶。 1999年发现DNA聚合酶Ⅳ和V 当DNA受到严重损伤时,诱导产生聚合酶Ⅳ和V。dinB 编码酶Ⅳ,umuC 和umuD 编码酶V。 聚合酶V使DNA能在损伤部位继续复制,而正常的酶在此部位因不能形成正确碱基配对而停止复制,由此,在损伤部位复制时形成错误倾向复制。 错误倾向复制的高突变率,虽杀死许多细胞,但由于克服了复制障碍,可使少数突变细胞存活。 DNA连接酶(DNA ligase) DNA短片段之间的连接由连接酶完成。 反应特性:催化双链DNA切口处的5’ -磷酸基与3’羟基生成磷酸二酯键。 T4 DNA连接酶: 连接DNA链间缺口和连接无单链粘性末端的平头双链DNA 研究发现:连接酶缺陷的E.coli 变异株的DNA片段 积累,对紫外线敏感性增加。 单链结合蛋白(SSB) 螺旋去稳定蛋白(helix destabilizing protein) 177个aa,在E.coli 中为四聚体。 原核细胞SSB与DNA结合有协同效应,第1个SSB和 DNA的结合可改变DNA空间结构,促使后面SSB结合。 SSB属复制辅助蛋白,为复制体及其它酶活性所必需 如:解开起点,维持螺旋酶的解旋活性,从DNA模板上去除二级结构和抑制核酸酶活性。 单链结合蛋白(SSB蛋白) T4噬菌体的32 kDa蛋白可以结合单链DNA,它还能使双链DNA在远低于解链温度时分开。大部分原核SSB蛋白与DNA结合时还表现出协同效应:如第一个SSB蛋白结合到DNA上去的能力为1,第二个SSB结合能力则可高达103。SSB蛋白的作用是稳定单链DNA。 DNA解旋酶 (DNA helicases) 绝大多数
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