13生物实验的基本技术.doc

第十三章 生物实验的基本技术 第一节 细胞学实验技术 【知识概要】 一、玻片标本的制作技术 制作玻片标本对认识生物体的形态结构具有重要意义。玻片标本有临时玻片标本（如涂片、压片、临时装片）和永久玻片标本（如永久装片、切片）。 1．涂片法 涂片法是将材料均匀地涂布在载玻片上的一种制片方法。 涂片材料有单细胞生物、小型藻类、血液、细菌培养液、动植物的疏松组织、精巢、花药等。 涂片时应注意：（1）载玻片必须清洁。（2）载玻片要持平。（3）涂层须均匀。涂抹液滴在载玻片中间偏右，用解剖刀刃或牙签等涂匀。（4）涂层要薄。用另一载玻片作推片，沿滴有涂抹液的载玻片面（二载玻片夹角应为30°～45°）由右向左轻轻推动，涂成均匀一薄层。（5）固定。如需固定可用化学固定剂或干燥法（细菌）固定。（6）染色。细菌用亚甲基蓝，血液用瑞氏染液。染色液要盖住全部涂面。（7）冲洗。用吸水纸吸干或烤干。（8）封片。长期保存用加拿大的树胶片片。 2．压片法 压片法是将生物材料置于载玻片和盖片之间，施加一定压力，将组织细胞压散的一种制片方法。 压片法的一般过程：（1）取材。观察细胞分裂，应选取细胞分裂旺盛、新鲜的组织细胞为材料。如根尖、茎尖分生组织、骨髓细胞、花药（花粉母细胞）。精巢（精母细胞）等。（2）固定。材料固定可根据需要而定，取材后立即压片观察，可不作单独固定处理（与染色同步进行）；取材后不立即视察，可将材料用固定液（一般用醋酸酒精固定液）固定。固定2～24小时（因材料而异）后用95％乙醇清洗，保存于70％乙醇中，备用。（3）离析。对细胞不易散开材料用水解分离液（如1N HCl或盐酸一酒精液）处理，一般处理6～20min，解离后经水漂洗后方能染色。（4）染色。染色剂种类很多。观察染色体常用醋酸洋红染色液染色。（5）压片。将材料放在载玻片上，加一滴清水或染液，盖上盖玻片用拇指轻轻压片。（6）观察。压片后，即可在显微镜下观察。 3．装片法 装片法是将生物材料采取整体封固制成玻片标本的方法，用此法可制成临时或永久装片。 装片材料有：微小生物如衣藻、水绵、变形虫、水螅，植物的叶表皮；昆虫的翅、足、口器，人的口腔上皮细胞等。 装片法制作时应注意：（1）手持载玻片时，应注意持平，或放在平台上。滴水时水量要适当，以恰好被盖玻片盖满为度。（2）应将材料用解剖针或镊子展开不使重叠，展平在同一平面上。（3）放盖玻片时，从一侧慢慢盖在水滴上，防止出现气泡。（4）染色时，将一滴染色液滴在盖玻片的一侧，用吸水纸从另一侧吸引，使盖玻片下的标本均匀着色。着色后，用同样的方法，滴一滴清水，把染色液吸出后，在显微镜下观察。 二、显微镜基本实验技术 1．低倍镜（4X、10X）的使用方法 显微镜操作主要包括两个方面：（1）光度调节。正确对光是能否成功地观察到物象的首要条件。对光时，先把聚光器上提，打开可变阑，转动反光镜，这时一边看镜内视野，一边调节聚光器螺旋，直至视野内得到均匀而明亮的光线。（2）焦距的调节。调焦时，先把观察的切片，用推进器对正通光孔中央。然后分两步调焦。先用粗调器定焦，用左眼看目镜，使粗调器慢慢上升，直到能清楚地看到标本为止。随后调节细调器，使镜筒微微升降，至物象更清晰为止。 2．高倍镜（40X）的使用方法 （1）将在低倍镜中找到的物象欲放大部分移到视野中央。（2）转动物镜转换器，使40X物镜对准通光孔，转动时从侧面注视物镜，以防镜头紧压玻片。（3）调节细调螺旋，使物象清晰。 3．油镜（100X）的使用方法 （l）先用低倍镜找到欲观察细微结构，将其结构移至视野中央换高倍镜。（2）下降镜台，在玻片标本上滴一滴香柏油，转换油镜。从侧面注视油镜，把镜台上升，使油镜头浸在香柏油滴中。（3）转动细调螺旋，使物象清晰，进行观察。（4）观察完毕，用镜头纸擦去油镜头和玻片上的香柏油，再用少许二甲苯或乙醚 / 无水乙醇把镜头擦干净。 4．安装指针的简易方法 将目镜的上盖（一片透镜）旋下，剪取一小段头发（其长度约等于目镜的半径），用镊子夹住一端，将另一端蘸少许中性胶，将其粘在目镜内壁的金属光栏（一铁圈）上。稍干后，旋紧上盖，即可使用。 三、单细胞的计数方法 在细菌培养和体外细胞培养，以及环境监测血液检查中常常需要统计细菌、细胞、单细胞藻类、原生动物、血细胞、花粉等数量。细胞计数方法的原理是把一定体积的细胞液体，在显微镜下直接计算其个数，利用所得结果推算出每毫升水体中的单细胞数。具体方法如下： 1．水滴计数法 用管口圆而平滑、大小适宜的吸管，吸取1mL水，然后测定这一吸管1rnL水可滴出多少滴水（反复测定，直到准确为止）。这样可以计算出该吸管滴出的每一滴水的体积。用吸管取样时，如果单细胞是活动的要用碘杀死后，再计数；如果样品浓度太大，计数困难，按倍数稀释到适宜的浓度；另外，取样前必须搅拌，搅拌后