基因工程第九章重组DNA导入细胞精品.pptVIP

* * * * * * * * * * * * * * * * * * 第九章 重组DNA导入细胞 Transferring DNA to cells 转化 转导 转染 感染 结合 其它 一、转化 transformation 一种遗传转移方式 1928年 Griffith 首次发现 肺炎双球菌（Diplococcus pneumoniae） 少量无毒RII（无荚膜，粗糙） 大量杀死有毒SIII（有荚膜，光滑） 混合注射小白鼠 ?小鼠死亡?可分离出活SIII细胞 RII细胞 + SIII DNA 即一来自一个细菌细胞(供体)的DNA(片段)被另一个细胞(受体)所吸收(随后同受体染色体一起进行重组) 对DNA的吸收，仅在受体生长周期中的一个短暂阶段。能够吸收DNA的细胞，称作感受态细胞(competent cell) 肺炎链球菌产生的感受态因子能将感受态授于同一菌株的非感受态，而枯草芽胞杆菌的感受态因子似乎不能将感受态传给非感受态细胞。感受态因子可能是一种自溶酶(autolytic enzyme)，它能够产生或暴露结合DNA的受体位点 感受态的确定似乎涉及某些胞内蛋白质的合成 在肺炎链球菌和流感嗜血杆菌中，在最大感受态时期，群体中感受态细胞可达100%。 在B. subtilis中感受态细胞的比例似乎不超过10-15% 在转化中有功能的DNA是双链或ssDNA， 线状或环状 （一）CaCl2转化法 核心，目标细胞在CaCl2·H2O溶液中浸泡一段时间 E.coli：100mM E.coli: DH5?, TG1, XL-1Blue, JM105 吸附(adsorb)：感受态细胞和DNA混合，冰上30min 热激(heat shock)：42℃ 90 sec 恢复：1～2min 复苏：37℃ 150rpm摇床 45-60 min 感受态细胞的保藏：10%甘油＋0.1M CaCl2 -70 ℃ Mg2+, Co2+, Ru2+ , DMSO二甲基亚砜等可提高效率 转化效率 107-109 cell/?gDNA 转化子（transformant） （二）原生质体转化法 protoplast G+细菌，特别是芽胞杆菌(bacillus)，酶母(yeast) Lysozyme / 等渗环境下，脱细胞壁 ?细胞壁再生 原生质体融合 (三)电转化法（electroporation） 10%甘油(glycerol)或蔗糖(sucrose)，含(或不含)Mg2+ 离子 2.5 KV/0.2cm 25?F 200-400? Gene Pulse, Bio-Rad 公司 由噬菌体将细菌基因由一个细菌（供体）转移到另一个细菌（受体）的过程 二、转导（transduction） （一）普遍性转导 (generalized transduction) phage在供体烈解中，部分供体DNA被包装，当感染受体菌时，若感染复数(multiplicity of infection)小于1时，缺陷phage可将供体DNA注入受体(此时原phage DNA不感染) ?形成新的表型 完全转导：由噬菌体导入的DNA片断通过双交换整合到受体染色体上与寄主染色体同步复制，则称为完全转导(complete transduction)，如Salmonella typhimurium –P22，反之，则为流产转导(abortive transduction) (二) 局限性转导 Specialized (or restricted) transduction ? phage 不正确切离，以10-6比率存在 产生?dgal or ?dbio 当?dgal?(低感染复数)感染gal- E.coli时?得到gal+ E.coli 低频转移 高频转导 高感染复数时， ? 和10-6?dgal+ 共同感染?gal- E.coli(?+?dgal)?得gal+双重溶源菌?烈解?half ?和?dgal Transductant 转导子 attP gal attB bio chromosome integrate attL gal bio attR ? prophage a) integrate b) excision prophage attB attP ? attL attR Int+xls ? 转导噬菌体的形成 gal chlD pgl att BP’ N Rm’mA J att PB’ bio uvrB chlA 正常切离 ? 转导噬菌体的形成 不正常切离 gal chlD pgl att BP’ N Rm’mA J att PB’ bio uvrB chlA ? 转导噬菌体的形