NR1-TFR重组表位疫苗制备及其在真核细胞中表达.pdf

参考文献……………………………………………………………………·59 致谢………………………………………………………………………………………………·62 文献综述…………………………………………………………………“63 参考文献……………………………………………………………………71 …IIII I II III I I I II III IIl Y1889218 NRl．TFR重组表位疫苗的制备及其在真核细胞中的表达 摘 要 目的：N一甲基一D一天冬氨酸受体(N—Methyl-D-Asparate 广泛参与应激、脑损伤、药物成瘾、疼痛等病理生理过程。选择性阻断 NR活性可能成为相关疾病的治疗手段。现有的NR拮抗剂或阻断剂均为 人工合成的小分子药物，由于作用选择性低常引起幻觉、焦虑不安、意识 模糊等严重毒副作用，并存在难以超早期用药的问题。NRl是NR的功 能亚单位，具有NRl的一切电生理学特性和药理学活性。NRl口服疫苗 可能是超早期调控机体应激、防止脑损伤、减缓药物成瘾和治疗疼痛等的 可行方法之一。但需要有载体携带进入血脑屏障发挥作用，而转铁蛋白受 体单克隆抗体OX．26是迄今被认为最有前途的脑转运载体，它可携带 NRl抗体通过血脑屏障，从而使得NRl抗体能够在中枢神经系统发挥作 用。因此，本研究旨在用噬菌体肽库展示技术模拟小鼠NRl和TFR的抗 原表位，构建NRl．TfR融合蛋白真核表达载体，构建单B细胞表位疫苗。 MAB363的抗原表位筛选(本课题前期研究已完成)，筛选小鼠转铁蛋白 受体单克隆抗体0X．26的抗原表位优势克隆，(2)计算机模拟表位融合 抗原表位优势克隆通过linker串联人工合成重组表位肽，进行功能检测； 备重组表位疫苗；(5)通过westernblot技术检测质粒在真核细胞中的表 达。结果：(1)通过噬菌体十二肽库展示技术筛选出小鼠转铁蛋白受体单 blot检测， 均能在2KD．8KD范围内产生条带，提示B细胞表位筛选正确，重组表位 质粒设计合理，所表达的蛋白能够有效和相应抗体特异性结合。(2)将 立功能和空间构象，命名为S。采用相关软件预测重组表位蛋白Pro．S空 间构象：Pro．S蛋白质序列在BLAST蛋白数据库中未发现同源性较高 (30％)的蛋白质，其内不含信号肽，属非跨膜蛋白，且不含半胱氨酸而 未形成二硫化合物影响蛋白折叠和功能发挥，不含0【螺旋以保证结构的 稳定；NRl和TFR的抗原表位处于蛋白分子的表面，具有良好的抗原性、 亲水性，提示Pro．S抗原性较好，可能刺激机体产生免疫反应并产生相应 09cfu／ml 命名为vec-s．并成功将其转化至减毒沙门菌，制备浓度为1．6×1 OX．26分别做westernblot一抗检测时，在2KD．8KD范围内可见相应条带， 与预测的分子量大小符合，提示真核表达质粒vec．s可在真核细胞中表达。 结论：成功构建了NRl．TFR重组真核表达质粒，初步验证真核表达质粒 vec．s能够在真核细胞中表达El的蛋白。为下一步的动物实验奠定了基础。 关键词：N．甲基．D．天门冬氨酸受体；转铁蛋白受体；抗原表位；表位 疫苗；pcDNA3．1(+)；疫苗；应激；小鼠；空间结构；转染 The ofNRl／TFRrecombinedvaccine preparation epitope andthe in cell eukaryotic expression in Abstract：Objective：N-methyl-D—as