第九章 酶蛋白质工程.ppt

定向进化的筛选策略 琼脂板涂布法 在特殊条件下培养突变菌，通过宿主菌的生长情况、培养基颜色、特定反应的出现等判断是否具有目的基因。 微孔板悬浮法 在含生色底物平板上培养，挑取具有活性的克隆接种到96孔板上检测吸光度。使用微流控芯片。 微球细胞固定法 与数字成像系统结合，将单个细胞附着在单个固体珠上，突变体进行分离和筛选。 流式细胞计数法 细胞经荧光染色后，通过高速流动系统，排成单行，逐个通过流式细胞计数仪进行测定。 突变体分离 通过酶促反应的特征 加入底物显色 荧光共振能量转移 同位素标记底物 通过检测底物消耗或产物生成进行终点检测 酶检测 信号探测 分光光度计和荧光酶标仪 气相色谱和高效液相色谱 质谱和核磁 定向进化与自然进化的异同点 定向进化的实质是达尔文进化论在分子水平上的延伸和应用。 定向进化是在体外模拟突变、重组和选择的自然进化，使进化朝着人们需要的方向发展。 两者的不同： 进化动力不同： 保守突变 非保守取代； 进化方向不同： 适应突变的积累； 进化速度不同： 非常漫长 只需几年、甚至几天； 进化目标不同： 适应环境 超越生物学意义的要 求，探索所希望的蛋白质在顺序空间的可及性。 定向进化技术 目标酶 所需功能 方法 结果 实施菌种 卡那霉素核苷基转移酶 热稳定性 定位诱变+选择 在60-50℃酶半衰期增加200倍 耐热脂肪芽孢杆菌 枯草杆菌蛋白酶 作用于有机溶剂 易错PCR+选择 在60％二甲基亚砜主仆女冠活力增强170倍 枯草杆菌 β-内酰胺酶 作用于新底物 DNA改组+选择 对cefotaxime的抗性增加32000倍 大肠杆菌 对硝基苯酯酶 有机溶剂中的底物特异性和活性 易错PCR+重组 活力增加60-150倍 大肠杆菌 胸苷激酶 第五特异性 基因理疗 交错延伸+选择 活力增加43倍 大肠杆菌 β-半乳糖苷酶 底物特异性 DNA改组+选择 活力增加66倍 特异性增加1000倍 大肠杆菌 定向进化的应用 蛋白质工程改造的实际应用 枯草芽孢杆菌蛋白酶： 一种丝氨酸蛋白酶，是工业上应用很广的酶，在 洗涤剂、制革、丝绸等多种行业上有广泛的用途。 分子量较小，27.5kDa，功能研究的比较清楚， 产生菌的基因也已经被克隆，并已建立合适的表 达载体系统，是蛋白质工程的理想的研究对象。 (succinyl)-Ala-Ala-Pro-X-p-二硝基苯胺 展望 总之，具有新功能和特性的酶可以通过从大量未知的自然种系中寻找以及对现有的天然酶进行改造，对现有的天然酶进行改造可能更加合适。 随着基因工程技术、蛋白质工程技术以及高通量筛选技术的迅速发展，定向进化技术将成为获得新酶的一个有效快捷的手段，这将为工业生产提供更多性能优良的酶制剂。 本 章 小 结 酶的蛋白质工程概念？ 酶的定向进化？ 随机突变的方法有哪些？ 酶的蛋白质工程的目标？ 学习动物精神 11、机智应变的猴子：工作的流程有时往往是一成不变的，新人的优势在于不了解既有的做法，而能创造出新的创意与点子。一味 地接受工作的交付， 只能学到工作方法 的皮毛，能思考应 变的人，才会学到 方法的精髓。 学习动物精神 12、善解人意的海豚：常常问自己：我是主管该怎么办才能有助于更好的处理事情的方法。在工作上善解人意， 会减轻主管、共 事者的负担，也 让你更具人缘。 第九章  酶的蛋白质工程 蛋白质工程 蛋白质工程： 是以蛋白质空间结构及其与生物学功能的关系为基础，通过分子设计和由设计结果所指导的特定的基因修饰，而实现的对天然蛋白质的定向改造。 目的： 是为构造并生产性能比现有蛋白质更加符合人类需要的蛋白质新品种提供科学依据和技术途径，同时，为分子生物学的基础理论研究提供强有力的新手段。 蛋白质的结构 1952年丹麦生物化学家Linderstrom-Lang首次提出蛋白质三级结构的概念： 一级结构：指多肽链中氨基酸的一定的顺序，靠共价键维持多肽链的连接，而不涉及其空间排列。 二级结构：指多肽链骨架的局部空间结构，不考虑侧链的构象及整个肽链的空间排列。 三级结构：指整个肽链的折叠情况，包括侧链的排列，也就是蛋白质分子的空间结构或三维结构。 1958年英国晶体学家Bernal提出四级结构概念： 四级结构：指蛋白质亚基的排列。 蛋白质的超二级结构和结构域 超二级结构：1973年Rossman提出，指二级 结构的组合物。 结构域：由Porter提出，是指蛋白质分子中 那些明显分开的球状部分。 蛋白质工程就是对自然界存在的蛋