副溶血弧菌常规查及其3种基因(tlh、tdh及trh)lamp检测方法的研究.pdf

方法的研究 摘要 受该菌污染的食物后会引起腹泻、呕吐等症状，甚至导致脱水、休克及死亡。目 前，副溶血弧菌引起食物中毒的发生规模呈明显扩大趋势，已成为我国首要的食 源性致病菌。因此，对副溶血弧菌进行常规调查，了解其分布、形态和类型以及 发展新型副溶血弧菌检测方法就显得尤为重要。当前，虽然国内外已有采用环介 isothermal 导等温扩增技术(100p．mediated 菌的相关报道，但是仍存在成本高、耗时长、不稳定和易污染等不足，因此迫切 需要一种新型的检测副溶血弧菌的方法。 目的：了解市售水产品中副溶血弧菌污染情况并建立简便、快速和灵敏的新型 LAMP检测副溶血弧菌基因tlh、tdh和trh的方法。 方法：一、在食物中毒高发季节采集鱼、虾、贝、蟹及头足5类20种共161份样本， 然后按照传统培养法和生理生化法进行副溶血弧菌分离和鉴定，之后采用普通PCR 法检测副溶血弧菌的芒J鹰因进行验证，并对其毒力基因(tdh和trh)进行检测和 分布统计分析，最后采用11种O群分群血清对分离到并验证的副溶血弧菌进行血清 分群研究。二、针对副溶血弧菌种特异性基因．不耐热溶血毒素基因(砌)的6个特 异性位点设计l套LAMP引物，通过对反应体系(镁离子浓度、甜菜碱浓度、内外 引物比及环引物加入与否)及反应条件(反应温度和反应时间)的优化建立副溶 采用LAMP法检测梯度稀释的标准菌基因组DNA、纯培养的副溶血弧菌及贝类模拟样 本评价其检测敏感性，并与普通PCR法检测敏感性对比分析评价其应用价值。三、 针对副溶血弧菌种特异性基因一溶血毒素基因(tdh及trh)的6个特异性位点分别设 和砌基因的LAMP检测，观察其检测特异性并评价该方法的现场应用价值。 结果：一、通过传统方法分离和鉴定及PCR验证，161份样本中共检出副溶血弧菌 I 45株，平均检出率为27．95％，不同种类水产品中V p的检出率有显著性差异舒= 11．20， 因的LAMP检测在8 mM镁离子、0M甜菜碱、8：1的内外引物比、加入40mM环引 均阳性，其它菌和空白对照都阴性；该方法检测标准菌基因组DNA最低检测限可 的LAMP检测法检；澳U74株食源性病原菌中，7株含tdh基因的副溶血弧菌均为阳性， 副溶血弧菌为阳性，其余均为阴性。 结论：．本研究副溶血弧菌常规调查对上海市市售水产品中副溶血弧菌的分布情况 简便、快速、高灵敏度和高特异性，进一步优化、完善和推广后有望应用于现场 水产品中副溶血弧菌的监测。 关键词副溶血弧菌；环介导等温扩增技术；不耐热溶血毒素基因；耐热直 接溶血素基因；耐热溶血相关溶血素基因；快速检测 II Rroutine ofVibrio anddetection investigation parahaemolyCUS of3kindsof inVibrio mediated gene parahaemolycusbyLoop isothermal amplification(LAMP) ABSTRACT Vibrio isan foodbome eat parahaemolyticusimportant pathogen．吼r1．1enpeople foodscontaminated andother byit，diarrhea,vomitingsymptoms，evendehydration, anddeathwill