常温sc-rc dna扩增技术研究.pdf

摘要 常温SC-RCADNA扩增技术研究 摘 要 特定核酸序列的扩增技术已经成为分子生物学的一项基本技术。用于特定核 酸序列的扩增技术可以分为两大类，温度循环扩增和恒温扩增。 DNA克隆技术是一种需要借助大肠杆菌宿主菌来进行DNA扩增的技术，应 用检测中操作较复杂。PCR技术是一种体外快速DNA扩增技术，然而必需高速 变温控温，需要特定的仪器。尤其是在食品的安全监测、大量样品的同时处理、 需要高通量、快速DNA扩增时，成本高，效率低，很难达到实际应用。 恒温DNA扩增技术对于快速检测具有极大优势，它除不需要特殊的控温设 备外，也能在短时间内产生大量的扩增。LAMP技术是一种简便高效的DNA扩 增技术，但是一旦产生非特异性扩增，并不能及时发现。这就影响了该技术的检 测特异性。此外，该技术的引物设计繁琐。和LAMP技术一样，滚环扩增(Rolling Circle 增方法主要是锁式探针RCA(Padlock．RCA)。这种方法只是一种信号扩增方法， 探针与模板的结合经常出现错误，产生非特异性扩增，而且长探针的合成成本也 相对较高。 I)酶切目标DNA，通过优化的DNA 切位点的限制性内切酶(TspR Ligase的特 DNA 异连接将酶切片段和经过特异设计的接头连接成环，用phi29 polymerase 扩增，实现目标DNA的滚环复制。省去了长锁式探针的高成本合成，同时酶切 的粘性末端具有9个碱基，能够保证连接成环的特异性。SC．RCA技术避免了 LAMP技术的非特异性扩增难以辨别的不足，又较Padlock．RCA成环简便，而 且不仅是信号扩增，也是一种模板扩增。在核酸快速检测技术方面具有十分广阔 的应用前景。 本论文主要研究了SC．RCA技术的特异性实验条件，敏感度实验和一些简 便化该技术的应用探索。 DNA 我们探究了SC—RCA的特异性实验条件，T4 Ligase的连接特异性条 min) 件如下：40。C温育10mill，随后缓慢冷却至25。C反应温度，经过短时(20 I 摘要 DNA 连接反应，特异地生成环状模板。Taq Ligase是一种耐热DNALigase，它 h，特异地生成环状模板。实验结果 的特异性连接条件如下：45。C条件下连接10 证明，影响SC．RCA反应特异性的关键实验因素主要集中在连接反应和扩增反 应中的引物使用。连接反应中的主要影响条件是反应的温度和合适的连接酶。 DNA SC—RCA技术的连接反应特异性条件为利用TaqLigase在45C条件下连接 h。 反应10 利用探究到的特异性连接实验条件进行敏感度实验，单纯片段条件下能够扩 增最低模板浓度为1pM，酶切质粒多片段条件下能够扩增最低模板浓度为10 aM flVl。我们还将SC—RCA技术与PCR技术进行了比较，PCR技术能够从100 的质粒模板中扩增m特定片段，敏感度较SC．RCA技术高，但是在混入其他基 因组的情况下，PCR技术容易产生非特异性扩增，而SC．RCA技术可以在这种 复杂条件下扩增出特定的模板片段。 DNA 我们还对SC．R