海洋弧菌qy13褐藻胶裂解酶的研究.pdf

海洋弧茵0Y103褐藻胶裂解酶的研究 摘要 褐藻胶是由p．D．甘露糖醛酸和Q．L．古罗糖醛酸两种糖单元通过1，4糖苷 键聚合而成的线性大分子，主要存在于海带、马尾藻、巨藻等褐藻的细胞壁 和细胞间质。另外，假单胞菌属、固氮菌属等细菌也可以产生胞外褐藻胶， 但在B．D．甘露糖醛酸的2位或3位上发生O．乙酰化。铜绿假单胞菌是临床最 常见的条件致病菌之一，它产生的乙酰化褐藻胶决定其生物膜(biofilm)的 结构和功能；一旦形成生物膜，铜绿假单胞菌将具有极强的抗生素耐药性(比浮 游细菌高100--1000倍)和逃避机体免疫系统攻击的能力，导致临床上持续性、 难治性感染。因此，乙酰化褐藻胶是铜绿假单胞菌重要的致病因子。 褐藻胶裂解酶能通过13．消去反应裂解褐藻胶的1，4糖苷键，在非还原性 末端生成带有C4。5双键的不饱和糖醛酸。褐藻胶裂解酶在褐藻胶寡糖制备、 防治铜绿假单胞菌感染、海藻研究等方面具有巨大应用前景，尤其在防治铜 绿假单胞菌感染方面可能为解决细菌的耐药性开辟新途径。但目前所发现的 褐藻胶裂解酶只有少数几种可以降解细菌产生的乙酰化褐藻胶，且比活力 低，受人体中各种离子(如Ca2+、Zn2+)的抑制作用较大，所以难以用于临 床治疗。因此，高活力、高特异性的褐藻胶裂解酶的发现就成为研究的热点。 本文利用以褐藻胶为唯一碳源的选择性培养基，从青岛近海筛选到褐藻 胶裂解酶产量较高的菌株32株，其中菌株QYl03酶活力最高，对褐藻胶和 乙酰化褐藻胶的酶活分别达到5．87U／mL和4．22U／mL。通过形态观察、生 理与生化特征测定、系统发育学分析，将菌株QYl03鉴定为弧菌属细菌。 经过条件优化，得到弧菌QYl03最佳发酵培养基配方(％，w／v)：褐藻 酸钠0．5，NH4N030．2，KH2P04 0．6，NaCl O．01， 0．4，K2HP04 3．0，MgS04 FeS04 5．5。最佳发酵条件为：按3％(v／v)接种量接种培养基，28 O．01，pH ℃150 r／min振荡培养72 h。优化后，QYl03到达产酶高峰的时间由4天缩 短到3天，褐藻胶裂解酶最高产量由5．87U／mL提高到45．26U／mL，增加了 6．7l倍。 利用硫酸铵分级沉淀、离子交换层析、凝胶过滤层析从弧菌QYl03发酵 液上清中纯化到一种新褐藻胶裂解酶，纯化15．13倍，得率为29．8l％。 SDS．PAGE表明达到电泳纯，分子量为35．6 kDa，命名为AlyVII。褐藻胶裂 解酶AlyVlI的比活力为1863．45U／mg，最适温度40C，在30(2下稳定；最 适pH 6．0，在pH 解酶AlyVII能降解各种来源(包括褐藻和铜绿假单胞菌)的褐藻胶，对褐藻 来源的褐藻胶和poly(M)片段降解能力更强。 利用96孔板模型和flow cell模型检测了褐藻胶裂解酶AlyVII对7株铜 绿假单胞菌菌株生物膜形成的抑制作用和对已形成生物膜的清除作用。 AlyVII对其中6株具有抗生物膜作用，总有效率达到85．7％。50rtg／mLAIyVII 即对4株菌株生物膜形成的抑制率超过80％，对6株菌株生物膜的清除率为 35．28％--65．77o／。100 I_tg／mLAIyVII则对5株菌株生物膜形成的抑制率和对 已形成生物膜的清除率均超过80％。褐藻胶裂解酶AIyVII与庆大霉素联合 使用，能提高庆大霉素对其中6株菌株生物膜内细菌的杀灭能力，使其MBEC 降低16--64倍。褐藻胶裂解酶AlyVlI对铜绿假单胞菌的生长略有促进作用。 以上结果表明， AIyVII是第一个从弧菌中发现的能高效降解乙酰化褐 藻胶的新褐藻胶裂解酶，能有效抑制和清除铜绿假单胞菌生物膜，且在囊性 AlyVII的活性。因此，AlyVII有望发展成为一种辅助治疗铜绿假单胞菌生物 膜相关感染的药物。 关键词：褐藻胶裂解酶；海洋弧菌；铜绿假单胞菌生物膜；乙酰化褐藻胶； 细菌耐药