改良型环介导等扩增法检测金黄色葡萄球菌的研究.pdf

DEVELoPMENTANDEVALUATIoNoFA LooP．MEDI√订EDISoTHERMAL THERAPIDDETECTIoNoF ASSAYFoR STAPHYLoCICCUSAUREUS to AThesisSubmitted Shaanxi ofScienceand University Technology inPartialFulfillmentofthe forthe of Degree Requirement 2014 May 改良型环介导等温扩增法检测金黄色葡萄球菌的研究 摘要 aureus)广泛分布于自然界中，因此， 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus 该菌很容易污染食品，严重的甚至会造成食物中毒；金黄色葡萄球菌也是引 发临床性疾病的主要病原微生物，当前已有的常规检测方法耗时长、需要专 门的仪器设备或专业人才，不利于该菌的快速检测，因此，针对该菌建立一 种快速、灵敏的检测方法具有非常重要的现实意义，也将为解决当今食品安 全问题提供重要的技术支持。环介导等温扩增法(LAMP)能够高效、快速、 准确、灵敏的检测核酸，但该技术在检测过程中易产生假阳性结果，从而限 制该技术的广泛应用。本文建立了环介导等温扩增．单分子信标方法，快速、 准确地检测金黄色葡萄球菌，并对该方法及其检测特异性、灵敏度等方面进 行了研究。 本实验确定了金黄色葡萄球菌培养方法、作出了金黄色葡萄球菌的生长 曲线，确定了对数生长周期，并对该菌进行了平板计数，为后续LAMP及 SMB．LAMP检测方法的灵敏度确定提供了定量结果；通过选取不同的试验 然后用琼脂糖凝胶电泳进行验证实验，最终确定金黄色葡萄球菌基因组 DNA的最优提取方法为改良型SDS法；选取金黄色葡萄球菌特异性基因一 耐热核酸酶基因／／UC作为本实验中LAMP扩增的靶序列，并根据该基因的 株、酿脓链球菌1株、沙门氏菌1株进行同步检测，结果只有金黄色葡萄球 菌显示阳性，证明了该引物具有良好的特异性；针对提取的DNA模板进行 针对隔夜培养的金黄色葡萄球菌液逐渐进行10倍浓度梯度稀释，然后应用 改良型SDS法对稀释液分别进行DNA提取，最后对上述两种方法获得的 出100倍。 黄色葡萄球菌进行了快速、准确的检测，选定SMB—LAMP的反应条件为上 株以及沙门氏菌1株，对所设计的单分子信标进行了验证实验，最后确定根 据金黄色葡萄球菌FlUC基因所设计的单分子信标具有较高的特异性；同时， 对所建立的SMB．LAMP法检测金黄色葡萄球菌的灵敏度进行了确定，最终 测限为50龟，而以金黄色葡萄球菌液浓度梯度稀释液提取DNA为模板时， 异性及灵敏度。 关键词：LAMP，单分子信标，刀甜c基因，金黄色葡萄球菌 DEVELoPMENTAND A EVALUl鲴【1IoNoF LooP—MEDIA，TED ISoTHERMAL ASSAYFoRTHERAPID DETECTIoNoF STAPHYLoCICCUSAUREUS ABSTRACT