热处理废弃重组粒DNA的有效性与安全性分析.pdfVIP

摘要 摘要 随着现代生物技术，特别是基因工程技术的高速发展，其对生态环境与人 民健康可能造成的危害越来越引起人们的重视。生物实验室产生的废弃重组 DNA片段的排放是造成重组DNA向自然界扩散的途径之一，并有可能导致“基 因污染”，为此生物实验室含重组DNA片段的废弃物一般需经预处理后排放。 热处理是且前生物实验室处置废弃重组DNA片段、核酸等物质的主要手段。本 文以pET-28b质粒为材料，采用定量PCR技术结合电泳和质粒转化等手段研究 了重组DNA片段在热处理过程中的降解与失活规律及其影响因素，考察和分析 了热处理(热变性)的重组质粒DNA在模拟水环境中的降解速率以及潜在的环 境风险。研究结果将可初步确定热处理废弃重组DNA的有效性和安全性，并为 今后建立系统的废弃重组DNA生态风险评价技术和标准提供参考价值和技术支 撑。 实验结果显示，热处理过程中，．由于高温和煮沸过程中剪切力的作用， 后仍存在一级结构完整的质粒且仍具有3％～5％的转化活性。这表明热处理并不 能彻底降解、破坏重组DNA片段，而主要使其解链变性。 酸性条件能加速热处理过程中质粒DNA的降解，但环境中的离子强度、牛 血清白蛋白(BSA)浓度、EDTA浓度都对热处理过程中的质粒DNA具有一定 的保护作用，使其在热处理过程中的降解速率得到减缓，其中EDTA对热处理 过程中质粒DNA的保护作用最强。由于生物实验室废水中通常含有上述有机或 无机物质，因此实际热处理过程中质粒DNA的降解半衰期可能远长于2．7～4min， 这一点必须引起我们高度关注。 研究发现，热变性的质粒DNA经过复性可在一定程度上恢复其转化活性， 在一定范围内温度越高越利于热变性质粒的复性。因此热处理(变性)的质粒 DNA进入生态系统后如不能在短时间内被彻底降解，理论上存在着复性并恢复 转移活性的可能。 然而研究发现进入水环境的热处理(变性)重组DNA在短时间内并不能被 彻底降解。pH对热处理(变性)的质粒DNA在水环境中的降解有一定的影响， 摘要 在pH值为5、6、9的情况下，经过55min的降解，便无法从水中检测到一级结 构完整的质粒DNA的存在，其中pH为9时，热处理(变性)重组DNA在水 环境中的降解速度最快。pH值为7和8时，水环境中的热处理(变性)质粒DNA 降解速率相对较慢，到1．6h后才无法检测到一级结构完整的质粒DNA的存在。 水环境中的离子强度对热处理(变性)质粒DNA有一定的保护作用，而且这种 作用是随着离子强度的提高而增强。当水环境中NaCI浓度达到0．5％时，2．2h 之后仍然能在定量PCR中检测到一级结构完整的质粒DNA。 研究结果表明目前常用的废弃重组DNA沸水热处理手段难以彻底降解、破 坏重组质粒DNA的一级结构(主要使质粒DNA变性)，并仍具有一定的转化活 性。热变性的质粒DNA一定时间后能恢复生物活性，而且热处理后的重组质粒 DNA进入水环境后在短时间内并未被彻底降解，因此这些热处理(变性)的重 组DNA一旦进入生态系统后，理论上有足够的时间复性并可能发生基因转移， 所以该热处理方法存在一定的安全隐患。 有关进入水环境中的热变性重组DNA的复性与转移的验证工作正在进行之 中。 关键词：模拟水环境，降解，变性／复性，基因污染，质粒DNA，热处理，质 粒转化，定量PCR Ⅱ Abstract ABSTRACT withthe ofmodem has Along developmentbiologicaltechnology,itsadversity from drawn attention．Theofwaste—recombination increasing discharge gene is ofthe for