球形红细菌as.1737偶氮还原酶的表达与特性研究.pdfVIP

球形红细菌ASI．1737偶氮还原酶的表达与特性研究 摘 要 由于具有稳定、易于合成、品种多样的特点，偶氮染料被广泛应用于印刷、造纸、 化妆品以及纺织印染等行业。偶氮染料及其降解产物多具有致癌作用，并能在环境中长 期存在，因此上述行业向环境中排放的含偶氮化合物的废水成为废水处理中的焦点问 题。 自然晃中的某些微生物体内含有偶氮还原酶，可用于含偶氮染料废水的生物处理。 一些微生物产生的偶氮还原酶可以在温和的条件下催化偶氮键的断裂，故对偶氮染料生 物降解体系的开发具有很重要的意义。此外，细菌的偶氮还原酶可以在细菌的细胞内大 量生产。因此，偶氮还原酶的发现、酶的性质研究和酶制剂的生产，对于研发生物降解 含偶氮染料废水的降解工艺不失为一条捷径。 本文主要从研究一株球形红细菌RhodobacterASl．1737对偶氮染料降解 sphaeroides 性能入手，通过实验表明，这株球形红细菌在光照厌氧条件下具有将多种偶氮染料脱色 的活性。紫外．可见谱图表明染料原始共轭结构被破坏而导致了脱色。分子结构较简单 的染料能相对获得较好的脱色效果。染料不能作为该菌生长的唯一碳源，染料的脱色需 要外加碳源的共代谢作用。蛋白胨作营养源的脱色效果，要明显好于葡萄糖、蔗糖和苹 果酸等。菌株在温度35-40℃，中性偏碱环境(pH=7—8)具有较高脱色率。 随后通过PCR方法获得了一偶氮还原酶的同源基因，并登录GcnBallk“。这一偶 达的融合偶氮还原酶。将粗酶液经琼脂糖凝胶吸附，洗脱获得该偶氮还原酶的纯酶液。 SDS．PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳表明这一融合蛋白的分子量为44kDa，与预测分子量符 合。通过凝血酶酶切，获得了非融合的偶氮还原酶。 采用测定一定反应体系的吸光度随时间的变化来考察偶氮还原酶在不同条件下对 偶氮染料的降解脱色速率。通过对反应体系pH值的考察，确定pH=8为该偶氮还原酶 脱色反应的最适口H。在20～90C之间考察温度变化对反应体系的影响，确定40C为该 GST-偶氮还原酶脱色反应的最适温度；50。C为非融合偶氮还原酶脱色反应的最适温度。 在最适温度和pH值下，考察了染料浓度对偶氮还原酶粗酶影响以及纯酶的动力学 Red 0和甲基橙的结构相对简单，易于降解。对结构相似的红色染料I、II、IⅡ的降解速 率分别是20．3 rain1，12．6Hmolnagprotein‘fillip1和1．1gmolmg lzmolnag protein1 lllirl1，表明染料在结构相似的情况下，随着分子量的增加，越来越难以降解。 protein1 抑制酶的活力。 以甲基红为底物，研究了非融合偶氮还原酶的降解动力学，及降解过程和机理。实 验研究表明，其酶促反应动力学的双倒数曲线为平行线，符合乒乓机理· 用}玎，LC．MS考察在偶氮还原酶催化下，偶氮染料脱色反应的产物，并由此对染料 的降解机理进行了探讨。实验结果表明，在偶氮还原酶催化下的偶氮化合物的还原反应， 存在着加氢偶氮苯类结构的中间体。由甲基红到对应的加氢化合物有可能是整个反应的 大连理工大学博士学位论文 控制步骤。 从本研究工作中所获得的结论，可为该偶氮还原酶制剂以后的应用及生物法处理含 偶氮化合物废水的工程设计及运行，提供基础性的知识 4T一1 关键词：球形红细菌，脱色，偶氯染料，偶氮还原酶，pGEX ——一．一 堡垄塾塑堕竺!：!!!!堡墨至垦堕堕塞姿皇丝丝堕塞 Abstract Azo are usedfor industriesaswell鹪textile dyeswidely printing，papermaking，cosmetic becauseoftheir dyeing chemical of and