棉花抗草甘膦基的表达及功能鉴定.pdf

摘 要 草甘膦是一种广谱灭生性、内吸传导型的优秀除草剂。其毒性机制主要是竞争性抑制莽草酸 途径中的EPSPS合酶，导致莽草酸途径中断，芳香族氨基酸合成受阻，从而扰乱生物体的正常氮 代谢最终导致生物体死亡。它具有结构简单、生产成本低、除草效果好、低毒无残留等特点，是 目前世界上使用面积最广的除草剂品种。但作为一种非选择性除草剂，它对农作物同样具有灭生 性作用，这大大限制了草甘膦在农业生产中的应用范围。近年来，由于抗草甘膦转基因农作物的 大规模推广，使得其施用更加方便，也为草甘膦的应用发展开辟了新的途径。目前已经商品化的 抗草甘膦转基因作物主要来源于美国孟山都公司。我国在该领域的研究起步较晚，目前还没有自 主研发的抗草甘膦作物品种进行商品化生产。因此，寻找拥有自主知识产权的草甘膦抗性基因， 尽快培育出高产优质的抗草甘膦作物新品种将是研究的重点内容。 本研究利用从高抗草甘膦的棉花自然突变株中克隆的抗草甘膦基因，通过构建原核载体 利用农杆菌介导的遗传转化方法，将该基因导入烟草中，以鉴定此基因能否赋予植物对草甘膦的 抗性功能。为作物的抗草甘膦基因工程提供优良的基因源。 Sac 1．用HindIIL 1．4kb的目的基因，连接到原核表达载体 I从载体pUCHWl99上切‘F 再用SDS—PAGE电泳检测蛋白。结果表明，该目的基因在大肠杆菌中得到了表达，并且在37℃， 诱导5小时蛋白表达量达到最大。 2．用EcoR 筛选，获得了54株T0再生植株。对得到的再生植株提取DNA，进行PCR扩增，结果表明，所 得到的54株抗性植株中有13株转进了外源抗草甘膦基因，对其作进一步的Southernbloaing分 析，结果进一步证明外源基因己整合到烟草基因组中。 3．对转基冈烟草和野生型的烟草进行草甘膦的抗性试验，用不同浓度的草甘膦进行涂抹烟 草离体叶片，5d后观察，结果表明转基因烟草叶片可抗0．5％浓度的草甘膦，而野生型烟草在0．2％ 浓度下表现出严重受害症状；整株烟草喷施草甘膦实验结果同样表明，转基因烟草比野生型烟草 草甘膦抗性有明显提高。 关键词：抗草甘膦基因，载体构建，原核表达，烟草遗传转化，草甘膦 Abstract isa Glyphosatewidelyused，broad—spectrum,inner-absorptionconducting inhibitsthe isthesixth enzyme synthase oftheshikimicacid isessentialforthe ofaromaticamino enzyme pathway,which biosynthesis acidsin conversion and the ofshikimate一3一 plants，bacteriafungi．EPSPsynthasecatalyzes algae，higher EPSPand 一phosphate(S3P)andphosphoenolphyruvate(PEP)tOyield inorganicphosphate(Pi)． isa inhibitorof it the siteof PEP,as an Glyphosatecompetitive occupiesbinding PEP．mimicking in