棉花叶柄高效再体系的建立与遗传分析.pdf

摘 要 利用遗传fT程技术改良棉花鼎种已经取得了巨大的经济效益和社会效益。农杆菌介导遗传转 化法是棉花的主要遗传转化方法之一，然而目前棉花的生物技术的发展仍然存在着很多障碍，在 棉花转基因技术中存在体细胞胚胎发生的基因犁依赖性、棉花组织培养的低效性(耗时，耗工)、 基因转化技术的复杂性(难重复，转化率低)和转基因棉花的农艺性状的变异等等，这些问题已 经成为棉花生物技术、棉花功能基因的验证和棉花相关基因克隆等研究领域的障碍和瓶颈。本研 究针对棉花组织培养中涉及的主要问题，从棉花组织培养外植体的选择、基冈型限制的遗传规律、 适合组织培养的特种棉花材料选育等方面进行初步研究，同时把棉花农杆菌介导法的遗传转化效 率提高了2。3倍，转基因周期缩短剑6个月，转化效率稳定在30％，为棉花功能基因的快速鉴定 与转基因材料的创造提供了技术支撑。取得的主要研究结果如下： 大田叶柄组织培养体系的建立：通过大田棉株叶柄愈伤组织的诱导、胚性愈伤组织的分化、 胚状体的萌发等试验，建立了CCRl24的叶柄组织培养体系，与常用的无菌苗下胚轴组织培养体 系相比，该体系培养周期和分化率均无显著差异，其分化率稳定在30％左右。同时解决了叶柄组 织培养过程中愈伤组织难以分化为胚性愈伤组织、胚性愈伤组织比来源于无菌苗下胚轴的胚性愈 伤组织更容易褐化的问题。①激素对褐化有一定的影响，调节激素的用量，也可以达到早出胚状 体的目的KT／6一BA组合中，6-BA的用量应介于0．08～0。16mg．L1之间较好，KT的用量在0．08～ 0．12 正常胚状体的比例较高②培养基中氮源的配比是棉花新分化的胚性愈伤组织在继代中出现褐化的 于防止褐化。 棉花叶柄愈伤组织分化率的遗传分析：通过研究发现，叶柄分化率分布符合正态分布，说明 叶柄分化率受数量基因控制。利用主．多基冈模犁分析发现：大田棉花叶柄的分化率主要受2对主 基冈控制。基因问存在加性、显性、上位性，该性状主基因遗传率在74．68％-83．22％。说明利用 育种手段可以选育出高分化率的材料。在控制分化率的基因中，也存在多基因效应，多基因解释 的遗传变异低，仅有】0．47—16．78％。 群分析与位点排序，对检测到的19个位点进行分析，有12个位点进入2个连锁群(LOD兰3．0)， 两连锁群分别包含5个和7个分子标记。根据连锁群长度从大到小顺序对各连锁群进行命名为 12．7cM，最大的遗传距离为43．3cM。应用复合区间作图法共检测到3个与分化率相关性状的QTL 另两个贡献率分别为14．4％和8．4％。 棉花叶柄组织培养特性：棉花不同部位的叶柄细胞在脱分化形成愈伤组织方面无显著差异； 在棉花植株生长发育的旺盛时期，即蕾期、盛蕾期、开花期、盛花期，植株不同部位、不同发育 时期的叶柄愈伤组织的生长速度有一定的差异；胚性愈伤组织分化率没有显著差异。到了棉花生 长发育的后期，随着叶柄的衰老程度增加，诱导出的愈伤组织状态发生改变，生长缓慢，但仍有 42．8％的分化率。说明叶柄是比较适合组织培养的外植体。 棉花叶柄遗传转化体系的建立：叶柄和无菌苗下胚轴对卡那霉素的耐受性不同，在用作遗传 转化外植体时抗生素筛选浓度不同，农杆菌浸染和适宜抗生素筛选条件下，抗性愈伤组织的诱导 1．8％，因此叶柄转化率是 率分别是84．3％和46．7％，而两者抗性愈伤组织分化率分别是65．1％和7 51．8％，无菌苗下胚轴的转化率是33．5％，利用叶柄作外植体的转化效率是无菌笛卜．胚轴的1．55 倍。叶柄抗性愈伤组织诱导率高的原冈也可能与叶柄横截面面积大，与农杆菌接触的细胞多有关。 棉花高分化率材料的选育体系的建立与遗传转化：应用叶柄组织培养体系，从CCRl24、冀 合312、中394中选育出叶柄分化率≥80％的株系lO个，其中有6株系的无菌苗下胚轴分化率也 高达100％。选育的株系分化能力可以稳定的遗传给后代，解决了棉花组织培养研究中由于分化率 不稳定而使培养体系不稳定的现象。从而建成了一套稳定的棉花组织培养体系。 初步利用选育的材料研究发现，棉花愈伤组织诱导培养基可以显著的影响愈伤组织的分化。 不同基因型材料对愈伤诱导与分化培养基的激素要求不一样。 利用选育的株系及其培养体系进行棉花农杆菌遗传转化，转化效率可以稳定在30—40％之间， 比CCRl24转化效率提高1．88倍。 关键词：棉花，叶柄组织培养，分化率，遗传转化，遗传分析，QTL定位，