农杆菌介导玉米交系受体材料筛选及遗传转化体系的建立.pdfVIP

摘要 在农杆菌介导的植物转基因技术应用过程中，由于大多数单子叶植物都不是农 杆菌的天然寄主。因此，禾本科植物尤其是重要的粮食作物如小麦、水稻、玉米长 期以来一直被排斥在农杆菌宿主范围外。直到二十世纪90年代以后由农杆菌介导 转化的这三大粮食作物才逐步取得成功。由于农杆菌是自然界存在的天然基因工程 载体，利用农杆菌转化的理论机理研究最清楚，并且该方法具有操作简单，费用低 廉，能够转入较大的外源DNA片段，插入拷贝数低，遗传转化频率高等优点，一直 以来是一种较为广泛使用的基因转化方法。玉米转基因研究的大量实践表明，幼胚 离体培养诱导出的胚性愈伤组织可作为理想的受体系统。在农杆菌介导的玉米遗传 转化中，受体基因型是影响农杆菌转化效率的一个重要因素，不同基因型之间转化 效率差异显著。为了扩大能被农杆菌转化且能再生的受体植物种类以及提高转化效 率，在过去lO年中，不少研究者在改造农杆菌，改变受体的培养条件，优化转化 系统上做了很多努力，但由于受体基因型限制，很多推广品种及自交系仍不能被农 杆菌转化，迄今为止，利用农杆菌介导转化的玉米受体材料仍然很少。 本研究以四川农业大学玉米研究所的70个优良玉米自交系幼胚为材料，在NB 培养基上进行离体培养。结果发现，供试的70个白交系的胚性愈伤组织诱导率存 通过4次继代，筛选出了胚性愈伤组织诱导率高、繁殖能力强、耐长期继代并且能 仅8．33％(6069、6077)。 为了进一步筛选出适合作为农杆菌介导的遗传转化受体材料，即对农杆菌敏感 的受体材料，本研究将筛选出的这10个自交系的胚性愈伤组织作为受体材料，分 别用农杆菌C58和GV330l对其进行转化，利用植物载体中携带的B一葡萄糖苷酸酶 fluorescence protein，GFP基因)的瞬时表达研究不同基因型受体材料对农杆菌的敏 感性。GUS瞬时表达率的统计分析结果表明，不同基因型受体材料问的GUS瞬时表 是再生性强且对农杆菌C58敏感的转基因受体材料。对10个基因型的GFP瞬时表 瞬时表达，说明这4个基因型受体对农杆菌GV330l不敏感，而其它6种基因型的 这3个对农杆菌GV3301敏感且具有高再生性的自交系材料。将有GFP瞬时表达的 阳性愈伤转入共培养基，继代2～3w后在荧光显微镜下仍能检测到绿色荧光。 很多个因素都会对农杆菌的转化效率产生不同程度的影响，成功转化往往需要 针对特定植物和组织进行多因素优化。本研究在进行农杆菌敏感受体材料筛选前， 分别对影响转化效率的一些转化条件进行了优化，如对材料的高渗处理，侵染时的 真空渗透，乙酰丁香酮的添加，最佳侵染时间和共培养天数的确定。统计分析结果 表明，对受体进行甘露醇高渗处理可提高转化效率，但高渗处理过度会严重影响绿 苗再生能力，因此，应根据受体基因型确定最佳高渗处理浓度。在侵染时进行真空 加As的转化效率间差异不显著；而在真空减压渗透时，加1009MAs与不加‘As的 转化效率的差异达到极显著。上述结果说明在真空渗透时添加1009MAs更能发挥 As提高转化率的作用。考虑到转化效率以及农杆菌对愈伤的毒害，在侵染时真空渗 透10min的情况下，共培养3天最适宜。 关键词：玉米自交系，胚性愈伤组织，农杆菌，GUS瞬时表达，GFP瞬时表达 Selectionof and ofMaizeInbred RecipientsEstablishing Lines Transformation by Geneticsand Wangyu(Major：CropBreeding) DirectedProfessorPan by Guangtang The transformationof the soilbacterium genetic plantsby Gram—negative tumefaciensisthe known of