毛细管电泳体内物分析方法研究及应用.pdf

Ph. D. Dissertation of Chongqing University Study on Novel Capillary Electrophoresis Approaches and Their Applications in Biopharmaceutical Analysis Ph. D. Candidate: Chen Hua Supervisor: Prof. Xia Zhining Major: Biopharmaceutical Engineering College of Bioengineering Chongqing University Oct 2007 摘 要 体内药物分析是通过分析手段了解药物在体内数量与质量的变化，获得各种 药物动力学参数、代谢的方式和途径等信息的一门学科。体内药物分析的对象具 有多样性，其样品（称之为生物样品）的特点是微量药物存在于大量的生物介质 中，待测组分浓度低，内源性物质干扰多。预处理和提高检测限是体内药物分析 需要克服的两大难题。本论文针对这两个问题进行探索，分别建立预处理简单的 透析进样毛细管电泳方法和灵敏的电化学安培检测法和化学发光检测法，考察了 方法的性能，并进行了应用研究。主要内容如下： 1．通过在毛细管进样端口内相转化法原位制备透析膜，建立了透析进样毛细 管电泳方法，使毛细管电泳同时具有分离和透析的功能。考察优化了膜制作的材 料和工艺，并对不同组成的成膜液制作的膜对大分子的拦截效果进行了研究。成 膜液配方为 20% PSf ，8% PEG 600，溶剂/非溶剂对为 DMF/H2O，挥发时间 30s， 成膜液和凝固浴温度分别为：35-55℃和 15-25℃。制作的透析膜可有效拦截以牛 血清白蛋白为例的大分子，即膜的截割分子量小于 65 kDa 。而采用25% 的PSf ， 不含 PEG 600 的成膜液制作的膜可部分拦截溶菌酶。 2 ．对具有透析功能的毛细管电泳方法的性能进行了评价。由于透析膜在毛细 管进样端原位生成，与毛细管结合紧密，透析单元和电泳单元之间几乎无死体积， 毛细管电泳分离的柱效损失小（咖啡因柱效35 000 /m ），电泳重现性好，连续 5 次进样扑尔敏峰高、峰面积 RSD 分别为 0.8%和 4.6% 。膜的稳定性好，pH 耐受 范围宽，寿命在 12 h。 3 ．对透析进样毛细管电泳方法应用于活体分析的可能性进行了研究。以小分 子扑尔敏和咖啡因混合溶液为对象考察进样峰面积与透析时间的关系，以咖啡因 为研究对象考察浓度与进样量的关系，表明该方法可以采用平衡透析进样，为活 体分析提供了可能。此外还进行了电化学检测研究（柱端安培检测），提高了检测 灵敏度，使本方法适用于体内低浓度样品的分析检测，扩大了本方法的使用范围。 4 ．透析进样毛细管电泳的实际应用。将本方法应用于咖啡牛奶中游离咖啡因 的直接分析。咖啡牛奶不需要任何预处理，蛋白等干扰小，测定步骤简单，测得 咖啡因的含量为 0.68 mmol·L-1 ；将本方法应用于内源性物质葡萄糖的测定，全血 样品用缓冲液稀释后直接进样，未经其他任何处理，测得血糖浓度 5.53 mmol·L-1 ； 将本方法应用于药物与蛋白的相互作用分析，测得了盐酸异丙嗪与牛血清白蛋白 4 -1 的结合常数为 1.47×10 L mol 。 5 ．采用柱后套管式接口建立了灵敏的毛细管电泳-化学发光检测法。对联用 I 体系的性能进行了考察，并用该法测定了贝诺酯在兔血中的代谢物——对乙酰氨 基酚的含量，获得了对乙酰氨基酚的药- 时曲线，对乙酰氨基酚的血药峰浓度为 4.60×10-3 g·L-1 ，达峰时间是4 h 。 6 ．采用高效液相色谱法研究了麻黄碱在家兔体内的药代动力学过程。获得了 家兔单剂量注射麻黄碱注射液的动力学参数，消除速率常数为 0.299 h