MUC1-ETR%2fpDC316载体介导的胰腺癌特异性MR分子显像初步的研究.pdf

MUCl一ETR／pDC316载体介导的胰腺癌特异性MR分子显像初步研究 1 MUCl-ETR／pDC36载体介导的胰腺癌特异性MR分子显 像初步研究 专业： 肿瘤学 硕士生： 陈邓林 导师： 谢德荣副教授 中文摘要 研究背景 胰腺癌是现今恶性程度最高、预后最差的肿瘤之一，早期诊断率低下是胰腺 癌死亡率极高的重要原因。目前常规的影像学及肿瘤标志物检查难以对胰腺癌作 出有效的早期诊断。黏蛋白1(MUCl)基因的异常表达已被证实是胰腺癌等肿 瘤的早期相对特异性分子生物学改变，转铁蛋白受体(T瓜)介导的分子显像可提 供分子水平的显像能力，将两者的优势联合构建一种新型的显像方法，可为胰腺 癌的早期特异性诊断提供帮助。在前期研究中我们扩增了lVIUCl基因启动子中 与组织特异表达有关的关键调控序列，并将不含有启动子及3’端不稳定序列的 T炽编码序列(ETR)置于该启动子的控制下，以pDC316穿梭质粒为载体构建 阳性的胰腺癌细胞中不受铁浓度负反馈调节，特异性表达大量TIP,，并被磁性探 针靶向标记而显像的潜力。 研究目的 16真核表达载体在mucl阳性细胞内的特异性表达。 1．验证MUCl．ETR／pDC3 2．通过体外MR成像探讨以TtR为报告分子反映细胞内mucl基因异常表达的可 行性，为体内实验和进一步靶向治疗研究打下基础。 MUCl．ETR／pDC316载体介导的胰腺癌特异性MR分子显像初步研究 材料方法 1．MCMV-ETR／pDC316阳性对照质粒的构建 EcoRI／Sal I／Sal 双向测序证实序列正确；将ETR基因与EcoRI双酶切后的pDC316质粒连 接并测序证实插入位置、方向及序列正确。 2．RT-PCR法鉴定各细胞株mucl基因的表达 扩增，2％琼脂糖凝胶分离产物，分析mucl基因表达情况。 mRNA表达的检测 3．细胞转染及转染后Tf8 各株细胞分为未处理组、阴性对照组、实验组和阳性对照组，后三组分别以 转染，在转染后0、24、48、72小时分别对各组取样，提取总RNA，实时荧光 mRNA表达。 定量PCR扩增TfR基因，观察不同时点各株细胞各处理组TfR 4．流式细胞术检测未处理组和转染后细胞表面TIP,表达 各株细胞分别转染实验组、阳性对照组质粒，在转染后48小时进行流式细 胞术检测，比较各株细胞各处理组细胞表面TfR平均荧光强度。 5．原子吸收分光光度法检测转染后细胞摄铁能力 将Pane一1细胞按实验组和阳性对照组转染相关质粒后48小时，于培养基中 吸收分光光度法测定细胞内铁浓度，另设未处理组和仅加Tf组为对照。 6．体外MR显像 各株细胞分别转染实验组和阳性对照组质粒，转染后48小时消化细胞，计 数后均取106个细胞标记抗人CD71免疫磁珠，进行体外MR显像，分析T2弛豫 率的改变。另设未标记细胞和明胶为对照。 7．统计学分析 所有计量数据均以均数±标准差表示，每组实验重复3批次。两个独立样本 之间的以t检验进行比较，检验水准为a=0．05，p0．05表示差异没有统计学意 11．0。 义，p0．05表示差异有统计学意义。统计学分析软件为SPSS n MUCl一ETR／pDC316载体介导的胰腺癌特异性MR分子显像初步研究 结果 1．MCMV-ETR／pDC316阳性对照质粒的构建 双酶切及连接反应后对所构建的载体进行双向测序鉴定证实序列及插入位 置、方向正确，成功构建MCMV-ETR／pDC316阳性对照质粒。 2．RT-PCR法鉴定各细胞株mucl基因的表达 在该位置无条带，各株细胞内参基因#