蛋白质的测定创新.pptVIP

第八章 蛋白质和氨基酸的测定第一节 概述 1. 蛋白质概况 蛋白质是含氮的有机化合物，分子量很大。主要由C、H、O、N、S五种元素组成。某些蛋白质中还含有微量的 P、Cu、Fe、I 等。 在食品和生物材料中常包括蛋白质，可能还包括有非蛋白质含氮的化合物，（如核酸、含氮碳水化合物、生物碱等；含氮类脂、卟啉和含氮的色素）。 第二节 蛋白质的定性测定 一、蛋白质的一般显色反应 电泳或纸层析之后用一些染料与蛋白质结合并变色。 氨基黑10B 溴酚蓝 考马斯亮蓝 酸性品红 氨基萘酚磺酸 二、复合蛋白质的显色反应 （一）糖蛋白的显色 1、过碘酸－schiff氏试剂显色法 2、甲苯胺蓝显色法 3、阿尔新蓝显色法 （二）脂蛋白的显色 1、苏丹黑显色法 2、油红－O显色法 第三节 蛋白质的定量测定 一般说来，动物性食品的蛋白质含量高于植物性食品。 一些蛋白质的含氮量一般为 15%~ 17.6%，有的上下浮动。可以测出总氮 N 一、 凯氏定氮法 由Kieldhl于1833年提出，现发展为常量、微量、自动定氮仪法，半微量法及改良凯氏法。书中只介绍前三种。 （一）常量凯氏定氮法 1. 原理 样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出。 ①　用H3BO3吸收后再以标准HCl溶液滴定。根据标准酸消耗量可以计算出蛋白质的含量。 ②　也可以用过量的标准H2SO4或标准HCl溶液吸收后再以标准NaOH滴定过量的酸。 整个过程分三步：消化、蒸馏、吸收与滴定 1. 消化 总反应式： 2 加硫酸铜 作为催化剂。还可以作消化终点指示剂（做蒸馏时碱性指示剂）。还可以加氧化汞、汞（均有毒，价格贵）、硒粉、二氧化钛。 2. 蒸馏 消化液 + 40%氢氧化钠加热蒸馏，放出氨气。 操作方法： “以奈氏试剂”检查氨是否全部蒸完， 以奈氏试剂——〔Nessler试剂，K2（HgI4）〕 检验NH4+离子，遇铵根，离子析 出黄色或红棕色沉淀。 配制方法1、 3.5 g KI + 1.3 g HgCl2 溶于70 毫升水。加30毫升4 mol/L氢氧化钠（或氢氧化钾）溶液，必要时过滤，并存于玻璃瓶中盖紧口。 方法2、 溶解11.5 g HgI2 + KI 10 g于适量少许水，后加水稀释至50 ml,静置后，取其澄清液，弃去沉淀，储存于棕色瓶中。 3. 吸收与滴定 1用4%硼酸吸收，用盐酸标准溶液滴定，指示剂用混合指示剂（甲基红—溴甲基酚绿混合指示剂）国标用亚甲基兰+甲基红。 指示剂 红色 绿色 红色 （酸） （碱） （酸） 2 用过量的 H2SO4 或 HCl 标准溶液吸收，再用 NaOH 标准溶液滴定过剩的酸液，用甲基红指示剂。 结果计算：121页 说明： ① 所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。 ② 消化时不要用强火，应保持和缓沸腾，以免粘贴在凯氏瓶内壁上的含氮化合物在无硫酸存在的情况下消化不完全而造成氮损失。 ③ 消化时应注意不时转动凯氏烧瓶，以便利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下，并促进其消化完全。 ④ 样品中若含脂肪较多时，消化过程中易产生大量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在开始消化时应用小火加热，并时时摇动；或者加入少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂，并同时注意控制热源强度。 ⑤ 当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，加入30％过氧化氢 2—3 m1 后再继续加热消化。  ⑥ 若取样量较大，如干试样超过5 g 可按每克试样5 m1的比例增加硫酸用量。 ⑦ 一般消化至呈透明后，继续消化30分钟即可，但对于含有特别难以氨化的氮化合物的样品．如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等时，需适当延长消化时间。有机物如分解完全，消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时，呈较深绿色。 ⑧ 蒸馏装置不能漏气。  ⑨ 蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色不生成氢氧化铜沉淀，此时需再增加氢氧化钠用量。氢氧化铜在70～90℃时发黑。 ⑩ 蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗管口，再蒸1分钟后关掉热源．否则可能造成吸收液倒吸。 （二）、 微量凯氏定氮法 1、原理及适用范围同前 2、与常量法不同点： 加入硼酸量有50 ml 10 ml, 滴定用盐酸浓度由0.1 mol/L 0.01 m