原核表达技术及其在相关领域的应用..pptVIP

原核表达技术及其在相关领域的应用 谨以此与朋友们交流学习 主要内容 基 因 工 程 基因工程：是用分离纯化或人工合成的DNA在体外与载体DNA结合，成为重组DNA，用以转化宿主（细菌或其它细胞），筛选出能表达重组DNA的活细胞，加以纯化、传代、扩增，成为克隆，产生出人类所需要的基因产物或改造、创造新的生物类型。 基因工程的应用领域 1.? 蛋白质功能研究 2. 生物制药和疫苗生产 3.? 疾病的基因治疗 4.? 食品、化工用酶制剂 5.? 抗虫、抗逆植物改良 6. 细胞代谢产物的富集 基因工程的操作工具 核酸分子剪刀限制性核酸内切酶 识别回文序列，产生粘性或平性末端，具有相同粘性或平性末端的不同DNA片段可连接起来形成重组DNA分子，故DNA限制性内切酶是分子生物学实验中重要的工具酶。识别双链DNA内部特异位点并裂解磷酸二酯键 分类：Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型 命名：EcoRⅠ(E：属名；co：种名；R：株；Ⅰ：发现次序) DNA聚合酶的3种功能 载体 基因工程中常用的载体(vector)主要包括质粒(plasmid)、噬菌体(phage)和病毒(virus)三大类。这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能，如有利于进行筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。 质粒载体 是存在于天然细菌体内的一种独立于细菌染色体之外的双链环状DNA，具有独立复制的能力，通常带有细菌的抗药基因。 最早使用的质粒DNA是人工构建的pBR322，该质粒分子大小为4.3kb，带有抗四环素和抗氨苄青霉素基因，含EcoRⅠ，BamHⅠ，HindⅢ等单一的限制酶切点。 质粒载体的特征 1.自主稳定复制 松弛型质粒 2.具有多种限制性内切酶酶切位点 3.遗传标记 4.插入容量大 5.分子量小，拷贝多 6.安全 目前常用商用载体 pJLA50X系列 pcDNAII; etc pET系列 (T7 promoter, Novagen公司) pQE系列 (T5 promoter, Qiagen公司) pMAL系列 (周质表达, BioLabs公司) pGEX系列 (GST融合表达, Pharmacia公司) pBAD系列 (Arabinose诱导型) 二、原核表达载体的构建 1. 目的基因的获取 2. 克隆载体的选择与构建 3. 外源基因与载体的连接 4. 重组DNA导入受体菌 5. 重组体的筛选 6. 克隆基因的表达 目的基因的获取 目的基因是人们所需要转移或改造的基因。如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因，还有植物的抗病（抗病毒、抗细菌）基因、种子贮藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因、干扰素基因等。获取目的基因的方法有 1.从染色体DNA中分离 2.人工合成 3.从mRNA合成cDNA 4.基因文库 重组体的转化 1. 重组体导入大肠杆菌 （1）氯化钙法 （2）电击法 （3）体外包装法 2. 重组体导入哺乳动物细胞 （1）磷酸钙共沉淀法 （2）脂质体介导法 （3）病毒感染法 （4）显微注射法 DNA重组体的筛选与鉴定 1.目的基因检测 2.DNA限制酶切图谱分析 3.根据重组载体的表型进行筛选 4.利用核酸杂交和放射自显影进行鉴定 常见注意事项 1.载体的选择 2.酶切位点的选择与克隆引物的设计 3.酶切反应的设计 4.酶切实验 5.连接比例的设置 6.连接温度与时间 7.感受态细胞的制备 8.转化 9.重组子的鉴定 具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定 有多个限制性内酶切位点，至少有两种酶能在同一体系中反应。 拷贝数高，表达量高，表达稳定。 具有强启动子和相应的表达标签和蛋白酶位点，便于表达产物的鉴定纯化。 酶切位点的选择 必须是选定载体的MCS上的两种酶切位点 尽量选用能产生粘性末端的限制性内切酶位点,并且上游酶切位点尽量靠近起始密码子。 目的基因中不能含有选用的酶切位点 两种酶尽可能在同一体系中反应，并且具有相近的切割效率 为了保证切割效率，在设计的克隆引物的酶切位点前面必须加上合适的保护碱基。 连接反应 连接比例的设置 连接比例目的基因与载体量3：1～8 ： 1，具体比例按 照跑胶条带的亮度与宽度设计。 经验公式： n（L1×K1×M2/L2×K2×M1）=1 (1n10) L1,K1,M1为目的基因的亮度，宽度，分子量，对应的为 载体的。如果超出范围按极值计算。 连接在16℃，12～16h. 实例分析