聚丙烯酰胺凝胶电泳方法及其原理a.docVIP

笫八部分 聚丙烯酰胺凝胶电泳 一、电泳的原理 电泳(electrophoresis)是指带电颗粒在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的现象。在生物化学及分子生物学中，主要是根据生物大分子所带电荷的数量及其在分子表面排布的不同来对它们进行分离和鉴定。电泳现象早在1809年就被发现，但将这种现象用于生物化学领域却萌芽于十九世纪初，1907年，有人曾研究过白喉毒素在琼脂中的电泳；1937年，瑞典的Tiselius建立了“移界电泳法”(moving boundary EP),成功地将血清蛋白质分成5个主要成分，即清蛋白、α1-、α2-、β-和γ-球蛋白。其后的几十年，电泳技术发展很快，各种类型的电泳技术相继诞生。以所采用的固体支持物区分，有纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳、纤维素或淀粉粉末电泳，聚丙烯酰胺凝胶电泳，琼脂糖凝胶电泳 表1 电泳技术的种类 类 别 名 称 型 式 ? 不用支持体的 电泳技术 1．? Tiselleas 2．? 3．? 4．? 5．? ? ? 属自由电泳 ? ? ? ? 用支持体的 电泳技术 1．? 2．? 3．? 4．? 5．? (1)淀粉胶 (2)聚丙烯酰胺 ①圆盘电泳法 ②平板法 ③SDS-凝胶电泳法 (3)琼脂糖凝胶电泳 (4)琼脂凝胶电泳 包括常压、高压电泳 (水平式或垂直式) ? 水平式或垂直式 (平板法、柱形法及线丝法) ? ? ? ? 垂直式(柱形法) 垂直式或水平式 垂直式(测分子量) ? 平板法或柱形法 (如免疫电泳) ? ? 其他用法 1．? 2．? —层析相结合 3．? 4．? ? ? 等；以电泳形式区分，有在液体介质中进行的，有将支持物做成薄膜或薄层的，有板形或柱形的等(表1)。电泳由于与光学装置、自动记录仪及自动部分收集器结合，又组成了等电点聚焦仪、等速电泳仪等等，80年代末发展起来的毛细管电泳(capillary electrophoresis)是在毛细管中装入缓冲液，在其一端注入样品，在毛细管两端加直流高电压实现对样品的分离…… 这些都极大地发展和扩大了电泳技术的应用范围。 电泳按其分离的原理大致可分为四类：区带电泳(zone EP，ZEP)、移界电泳(moving boundary EP，MBEP)、等速电泳(isotachophoresis，ITP)和等电聚焦(isoelectric focusing，IEF)。现将各种电泳分离原理简单介绍如下： 1．区带电泳 如图1(a)所示，不同的离子成分在均一的缓冲液系统中分离成独立的区带，可以用染色等方法显示出来，用光密度计扫描可得到一个个互相分离的峰。电泳的区带随时间延长和距离加大而扩散严重，影响分辨率。加不同的介质可减少扩散，特别是在凝胶中进行，它兼具分子筛的作用，分辨率大大提高，是应用最广泛的电泳技术。 2．移界电泳 如图1(b)所示，它只能起到部分分离的作用，如将浓度对距离作图，则得到一个个台阶状的图形，最前面的成分有部分是纯的，其他则互相重叠。各界面可用光学方法显示，这就是Tiselius最早建立的电泳方法。 3．等速电泳 如图1(c)所示，在电泳达成平衡后，各区带相随，分成清晰的界面，以等速移动。按距离对浓度作图也是台阶状，但不同于上述移界电泳，它的区带没有重叠，而是分别保持。 4. 等电聚焦 如图1(d)所示，由多种具有不同等电点的载体两性电解质在电场中自动形成PH梯度，被分离物则各自移动到其等电点而聚成很窄的区带，分辨率很高。 a b c d 图1 不同电泳法的分离原理示意图 a．区带电泳；b．移动界面电泳；c．等速电泳；d．等电聚焦 电泳技术由于具有快速、简便及高分辨率等优点，其应用十分广泛。从分离与分析无机离子到复杂的生物高分子化合物，以及在放射化学和免疫化学中都占有重要的地位；在生化实验室和生化工业方面应用更为普通；医药部门还用作临床诊断。在各类电泳技术中，尤以凝胶电泳在分离分析酶、蛋白质、核酸等生物大分子等方面分辨力为最高，为生物化学，分子生物学的发展作出了重大贡献。本文主要介绍聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理与技术。 (一)迁移率(泳动度) 1．电泳速度 设溶液中有一带有正电荷Q的颗粒，在强度为E的电场影响下移动，带电颗粒所受的力为F＝QE。同时此颗粒的移动受到方向相反的摩擦力F1＝f v的阻碍，f代表摩擦系数，v代表速度。当这两种力相等时，颗粒以速度v向前迁移(图2)。即 QE＝f v………………………………………………………………………(1) v＝QE/f………………………………………………………………………(2) ? 图2 带电颗粒在电场中迁移的受力情况