生物制药之基因工程均的培养工艺.pptVIP

基因工程菌的培养工艺 王林 唐霜 王良蕾 许蔚 徐元坤 发酵生产目的： 1、获得大量外源基因产物 2、减少宿主细胞本身蛋白质的污染 要求外源基因高水平表达 宿主、载体和克隆基因之间的相互关系及其所处的环境条件 培养基的影响 1 接种量的影响 2 温度的影响 3 溶解氧的影响 4 PH的影响 7 诱导时机的影响 5 诱导表达程序的影响 6 培养基为基因工程菌的生长和外源基因的表达提供一切能源物质。培养基的组成既要提高工程菌的生长速率，又要保持重组质粒的稳定性，使外源基因能够高效表达。 ①碳源：葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖及果糖等。 使用不同的碳源对菌体生长和外源基因表达有较大的影响。（见教材） ②氮源：酵母粉、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米浆和氨水、硫酸铵、硝酸铵、氯化 铵等。（酪蛋白水解物作为氮源有利于产物的合成和分泌） 培养基的影响 1 ③其他：无机盐、微量元素、维生素、生物素等，营养缺陷型菌株还要补加相 应的营养物质。 无机磷是许多初级代谢的酶促反应的效应因子，（如：DNA、RNA、蛋白质的合成，糖代谢、细胞呼吸、及ATP的水平控制），过量的无机磷会刺激葡萄糖的利用、菌体的生长和氧的消耗，但会影响目的基因的表达。即浓度低影响菌体的生长，浓度高外源基因不表达，故起始磷酸盐浓度应一般控制在0.015mol/L 左右较宜适。 问：为什么启动子只有在低磷酸盐的情况下才被启动？ ①定义：移入的种子液体积和培养液体积之比。 ②接种量的大小影响发酵的产量和发酵周期，量小，菌体生长的延迟期长，不利于外源基因的表达；量大，有利于对基质的利用，可以缩短生长延迟期，并使产生菌能迅速占领整个培养环境，减少污染机会，但会使菌体生长过快，代谢产物累积过多，反而会抑制后期菌体的生长；所以实际工作中，接种量的大小应取决于工程菌种在发酵液中的繁殖速度。 接种量的影响 2 在复制水平上 通过调控复制改变基因剂量来影响基因表达 在转录水平上 通过影响RNA聚合酶作用/修饰RNA聚合酶来调控基因表达 在其他方面 在mRNA降解和翻译水平上影响基因表达 调节细胞内小分子的含量 影响细胞内ppGpp（鸟苷四磷酸）的含量量 温敏扩增型质粒（见教材） 温度还影响蛋白质的活性和包含体的形成。 温度的影响 3 大肠杆菌合成青霉素酰化酶不仅受苯乙酸诱导和葡萄糖阻碍，还受温度调控。 16°C和18°C培养时，菌体生长较慢，从而影响翻译，即酶的合成。 杂交试验分析 结果表明，温度影响了青霉素酰化酶mRNA的浓度。 溶解氧是工程菌发酵培养过程中影响菌体代谢的一个重要参数，溶解氧浓度对菌体生长和产物生成的影响很大。 发酵前期，随DO2的下降，细胞生长减慢，ST值下降； 发酵后期，随DO2的下降，ST值下降幅度更大，外源基因高水平转录和翻译，细胞 需要更大的能量，需维持较高水平的DO2值(≥40%)，以促进细胞的呼吸作用，也 更利于外源蛋白产物的形成。 溶解氧的影响 4 Ccr：临界氧浓度，指不影响呼吸所允许的最低氧气浓度。 对于PL或PR启动子型工程菌来说，使用cI阻遏蛋白的温度敏感型突变株（cIts857） ?在28-30°C下培养时，该突变体能合成有活性的阻遏蛋白阻遏PL或PR启动子的转录 ?当温度升高到42°C时，阻遏蛋白失活，使PL或PR启动子启动转录，提高目的基因转录效率 一般在对数生长期或生长对数期后期升温诱导表达 因为此期菌数量多，生长旺盛 诱导时机的影响 5 对于PL或PR启动子型工程菌来说 细胞生长的温度突然升高10℃以上，细胞内就会产生热激蛋白，以适应环境温 度变化。若温度变化幅度不大，热激蛋白合成速度很快又下降，恢复正常蛋白 的合成。 问：如何减少热应激蛋白的产生？ 热诱导表达的工程菌通过在发酵罐夹层中通热蒸汽，2min内完成升温过程 诱导表达程序的影响 6 Notice: 如果升温时间过长，则热激蛋白合成剧增，外源蛋白含量相 对较低，给后期的纯化造成困难。