拟穴青蟹抗菌肽cygonadin及联合多肽scy-hepc的表达和抗菌、抗病毒功能研究.pdf

摘要 摘要 抗菌肽(antimicrobial peptide)是先天性免疫的重要组分，广泛存在于生物 界的各个门类，进化上相对保守，具有广谱的抗菌、抗病毒和抗肿瘤等作用。抗 菌肽具有可见的应用前景，但直接从动物体提取抗菌肽不适于未来产业化的要 求。本研究利用本实验室分离鉴定的拟穴青蟹抗菌肽Scygonadin基因和大黄鱼抗 Hepcidin基因联合的基因工程稳定表达菌株，优化其表达与纯化工艺，研究其基 因表达产物的抗菌与抗病毒活性、抗菌机制以及抗菌(毒)谱，为未来抗菌肽的 产业化提供技术支撑：同时利用基因表达产物制备Scygonadin的抗体，阐明了 其功能的深入研究奠定基础。主要研究结果如下： 为载体表达的Scygonadin主要以可溶性形式表达，经一次亲和纯化后即获得目的 蛋白，产量为65．9mg／L。体外抗菌实验结果显示，上述两种原核表达的Scygonadin 抗菌谱相似，能选择性地抑制革兰氏阳性和阴性菌，在所测浓度下对酵母和真菌 黄色葡萄球菌。比较发现，pET28．scygonadin是一个较理想的原核表达载体。 2．Scygonadin基因在毕赤酵母中的表达及其抗菌活性：体外构建了 醇诱导后在培养上清中检测到目的蛋白Scygonadin。并用亲和层析纯化表达产 具有较强的抗菌活性。 织的表达情况，发现与其基因的表达相对应，Seygonadin蛋白在射精管中高表达， 摘要 且显著高于其它组织。 4．联合多肽Scy-hepc在大肠杆菌中的表达、抗菌活性和抗菌机理：根据 (12．5“M，MBC)可在30分钟杀灭90％以上的金黄色葡萄球菌，在1．5．2小时 杀灭90％以上的施氏假单胞菌；Soy．hepc(50州，MBC)对藤黄微球菌具有相 对缓慢的杀菌过程，在4小时可杀死90％以上的藤黄微球菌。将原核表达的联合 Soy．hepc与施氏假单胞菌孵育2小时后，通过扫描电镜观察到施氏假单胞菌表面 结构崎岖不平，有泡状隆起，大量细菌可见内容物外泄。 5．联合多肽Sey．hepe在毕赤酵母中的表达、抗菌活性：通过优化密码子， 15后获得较高表达量。通过培养条件优化， pPIC9K．scy／hepc转化毕赤酵母GSI 6．0，甲醇浓度为0．75％条件下，诱导表达36小 Scy．hepc在培养基初始值为pH 时，可获得最高表达量，约为23mg／L。真核表达产物Sey-hepc具有广谱的抗菌 活性，与原核表达产物Scy．hepe比较，真核表达的Sey-hepe抗菌活性更强，对 水产致病菌如嗜水气单胞菌和荧光假单胞菌的抑杀菌活性(MIC1．6．3．2肛M)显 著高于原核表达产物Sey．hepc(MIC25．509M)。 学合成的Hepcidin成熟肽，以不同的方式作用于对虾白斑病毒(WSSV)，通过 检测病毒复制的极早期基因IEl的表达情况判断三种受试抗菌肽的抗病毒效果。 实验结果显示：真核表达产物Scygonadin和Scy—hepc具有一定的抗病毒活性； 而Hepcidin成熟肽具有显著的抗病毒活性，其不仅能够抑制WSSV对宿主细胞 Hpt的吸附，而且能够抑制WSSV在宿主细胞内的复制。 关键词：Scygonadin；Sey—hepc：重组表达；抗菌抗病毒活性；组织定位 Ⅱ Abstract Antimicrobialare ofthenaturaldefensesof peptidesimportantcomponents living was distribution theanimaland organisms．Itwidespread throughout plantorganisms， ancient with evolutionarilyweaponshi}ghactivity