无病毒可回复性肝细胞永生化载体的构建和结构鉴定.pdf.pdfVIP

现代消化及介入诊疗 2012年 第 17卷 第2期 ModemDigestionIntervention2012，Vo1．17，No．2 —61一 李 林 爱 建 1民 华2 · 论 著 · 王 刘 无病毒可回复性肝细胞永生化载体的构建 亚 思 东 德 和结构鉴定 王 泽 楠 张 摘【要】目的 构建不携带病毒基因且可回复的肝细胞永生化载体，优化 目前的肝细胞永生化方法。 洁 方法 构建含人端粒酶逆转录酶 (hTERT)基因的无病毒可回复性肝细胞永生化载体 ，PCR扩增attB1一 Kozak—hTERT(前端)一attB2和attB1-hTERT(后端)／E2MeGFP／F2A／neo—attB2．对相应大小条带切胶 回 收后 ，通过Gateway重组克隆技术罗BR反应和LR反应，以及酶切连接，构建最终 目的载体 PB-hTERT／ 晓 E2A／eGFP／F2A／neo。结果 PCR及酶切和测序鉴定均证实成功构建了肝细胞永生化载体PB-hTERT／ 藩 E2A／eGFPF／2A／neo，目的基因序列与GenBank报道一致。结论 成功构建不携带病毒基因且可实现回复 的肝细胞永生化载体，有望提高永生化肝细胞临床应用的安全性。 藏一 【关键词】生物人工肝；肝细胞永生化；人端粒酶逆转录酶；piggyBac转座子 群 Constructionandcharacterizationofavectorforvirus—freehepatocyte reversibleimmortalization Lf Ai—min,WANGYa-dong1．WANGZe-nanl,LUOXiao-bei~,YANOun1．BAIYang1．LINJian-hua2,uUsi— 白 de1．1)DepartmentofGastroenterology．2)DepartmentofHepatobiliarySurgery,NanfangHospital,Southern M edicalUniversity,Guangzhou 510515,China 杨 A【bstract】ObjectiveToconstructeavectorhTERTforvirus-freehepatocytereversibleimmortalization by optimizedtechnique．M ethodsTogetthevectorhTERTofrvires-freehepatocytereversibleimmortaliza- tion，weobtainedattB1-Kozak-eGFP ／F2A／neo-attB2，attB1-Kozak—hTERT—attB2andattBl_hTERT／E2A／ eGFP／F2A／neo—attB2throughPCRamplification，thenwerecoveredtheproducthtroughgelextraction，nad thenweconstructedhtevectorPB—hTER E『2A，eGF] A，neothroughGateway． arecombinnatclonetech- nologyincludingBRreactionnadLRreaction，andendonucleasedigestionandconjunction．ResultsThein- sertionnadcorrectorientationofthevectorPB—bTERT，E2A／eGFP／F2M neoandPB—eGFP，F2A ／neowascor卜 f