呼吸道合胞病毒单位疫苗的研究.pdf

摘 要 ialvi 呼吸道合胞病毒(Respiratorysyncytrus，RSV)属副黏病毒科， 肺炎病毒属，为非节段性的负链RNA病毒。RSV基因组有15，222个核苷酸， 主要编码1O个特异性蛋白，其中膜表面的融合蛋白F和粘附蛋白G是激发机 体产生保护性抗体的最主要的病毒表面抗原，是疫苗研究开发的重要内容。 呼吸道合胞病毒(RSV)广泛流行于世界各地，是引起婴幼儿下呼吸道感染 最常见的病原微生物之一。世界卫生组织(WHO)已将RSV疫苗列为全球疫 苗计划中优先发展的疫苗之一。RSV疫苗研制虽已有40年历史，但至今尚无 被批准使甩的疫苗。为此，本研究利用杆状病毒昆虫表达系统表达了RSV 全长的F、G蛋白，免疫BalbYcd,鼠，评价了F和G全长蛋白疫苗的免疫原性 和有效性。运用生物信息学软件选择F205223，255～278，G142～204位 氨基酸作为研究对象，表达并纯化了F-G融合表位蛋白。该研究为进一步研 制适合我国的RSV疫苗奠定了试验基础。 RSV F和G全长重组蛋白疫苗的质粒构建、表达和纯化 目的表达并纯化 RSV 隆了RSV A型Long株的全长F和G基因，构建了F-pFastHTA和G-pFastHT A质粒。将阳性重组质粒分别转化DHIOBac感受态细胞，获得重组杆状病 毒质粒F—Bacmid和G-Bacmid。将其转染昆虫细胞，成功包装了含有目的 片段的重组杆状病毒，采用Ni2+离子亲和层析柱纯化了接毒细胞的表达产 ern_b1 物。进行SDS—PAGE电泳、间接免疫荧光和Westot试验鉴定重组蛋 Ni 白。结果目的蛋白F和G在昆虫细胞中有特异性表达， 2+离子亲和层 析柱能够很好的吸附重组目的蛋白。结论成功克隆了RSVF和G基因，并 在Sf9昆虫细胞中获得表达。Ni2+离子亲和层析法纯化目的蛋白的纯度达 85％以上，可用于免疫Balb／c小鼠。 RSV F和G全长重组蛋白和表位肽疫苗免疫效果的研究 目的检测RSVF和G 蛋白候选疫苗的免疫原性和安全性。方法选用Mf59分别与F、G蛋白配制疫 苗滴鼻免疫Balb／c小鼠；弗氏佐剂与F和G蛋白配制疫苗肌肉注射免疫 Bal b／cd,鼠做为对照。分别采用间接ELISA法和微量中和试验检测免疫鼠血 清特异性IgG和中和抗体效价；间接ELISA法检测免疫鼠肺、鼻灌洗液特异 性IgG和SI 免疫鼠脾脏淋巴细胞y—IFN、IL-2、IL-4分泌。结果经杆状病毒昆虫表达 系统表达的RSV F和G全长蛋自在Balb／cd、鼠体内诱导产生了高滴度的血清 IgG抗体、中和抗体和肺局部抗体，其中F蛋白疫苗诱导产生了平衡的 IgGl／IgG2a。结论RSVF蛋白可刺激机体产生体液免疫和细胞免疫：G蛋白 疫苗只刺激机体产生体液免疫’，并引起Th2优势应答。 RSV F-G表位肽疫苗的质粒构建、表达及纯化目的选择能同时刺激机体 产生细胞免疫和体液免疫并诱导平衡的Thl／Th2应答的RSV表位蛋白。方 法运用生物信息学软件预测F和G蛋白的空间结构，并查看资料寻找F 和G蛋白的抗原表位。选择F205-223，255～278，G142～204位氨基酸作 为研究对象，合成编码这两段表位的基因，采用重叠PCR将编码F和G两 2+ 段表位的基因连接，杆状病毒昆虫表达系统表达F-G融合表位肽蛋白，Ni 亲和层析纯化目的蛋白。结果融合表位蛋白F-G在昆虫细胞中有特异性表 达， Ni 2+离子亲和层析柱能够很好的吸附重组目的蛋白。结论成功克隆 了RSVF-G融合表位基因，并在Sf9昆虫细胞中获得表达。Ni2+离子亲和 层析法纯化目．的蛋白的纯度达85％以上。 关键词：呼吸道合胞病毒；亚单位疫苗：表位肽疫苗；融合蛋白F；附着 蛋白G；免疫效果 subunitvaccineof studiesonrecombinant